ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 د کیمیاوي صنعت کیمیاوي اجزاو لپاره ډوپلیکس ویلډډ ټیوب، د SPECC1L کمښت د ټوټې شوي بندونو ثبات او د کرینیل عصبي کریسټ حجرو کمیدو لامل کیږي.

د Nature.com لیدلو لپاره مننه.تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).برسېره پردې، د روان ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کوو.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 ډوپلیکس ویلډډ ټیوب د کیمیاوي صنعت لپاره

Liaocheng Sihe SS مواد Co.، Ltd.یو مخکښ تولید کونکی دی چې د سټینلیس سټیل سیملیس پایپونو ، روښانه انیل شوي ټیوبونو ، بې سیمه کویل شوي ټیوبونو وغيره کې تخصص لري.د پیرودونکو د اسانتیا لپاره، موږ ویلډ شوي پایپونه او ټیوبونه هم لرو.Liaocheng Sihe SS مواد Co.، Ltd.ترټولو پرمختللي تولید او ازموینې تجهیزات لري.موږ کولی شو ستاسو اړتیا په بشپړ ډول پوره کړو.د معیار سره سم خورا سخت، ټیوبونه چې زموږ لخوا تولید شوي تل د OD او WT زغم لري.د زغم کنټرول په کلکه د تولید معیارونو سره سم دی.زموږ محصولات تل د پیرودونکو څخه راضي دي.پیرودونکو زموږ محصولات اخیستي چې ډیرې ګټې یې رامینځته کړي.
a) OD (بهرنی قطر): له 3.18mm څخه تر 101.6mm پورې
ب) WT (د دیوال ضخامت): له 0.5mm څخه تر 20mm پورې
c) اوږدوالی: د پیرودونکي اړتیا سره سم
d) معیارونه: ASTM A312؛ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etc
e) د پروسې طریقه: ERW، EFW او نور

سلایډونه په هر سلایډ کې درې مقالې ښیې.د هر سلایډ له لارې حرکت کولو لپاره شاته او بل بټن وکاروئ، یا د سلایډ کنټرولر بټن په پای کې د هر سلایډ له لارې حرکت وکړئ.
د کرینیل عصبي کریسټ حجرې (CNCC) د جنین عصبي فولډونه له مینځه وړي او د فارینجیل آرچونو ته مهاجرت کوي ، کوم چې د مینځنۍ مخ ډیری جوړښتونه تشکیلوي.د CNCC dysfunction د orofacial cleft په etiology کې مهم رول لوبوي، یو عام زیږون خرابوالی.Heterozygous SPECC1L بدلونونه په هغو ناروغانو کې موندل شوي چې په غیر معمولي او سنډرومیک کلیفټ اخته دي.دلته، موږ د کینونیکي چپکونکي جنکشن (AJ) اجزاوو، β-catenin او E-cadherin په کلتور شوي SPECC1L دستک کولو حجرو کې د لوړ شوي داغ راپور ورکوو، او د الکترون مایکروګرافونه د AJ apical-basal diffusion ښیي.د SPECC1L رول په کرینیوفاشیل مورفوګینسیس کې درک کولو لپاره، موږ د سپیک 1l نیمګړی موږک ماډل جوړ کړ.Homozygous mutants د جنین وژونکي دي او د عصبي ټیوب بندیدل او د CNCC لامینیشن خرابوي.د AJ پروټین داغونه په متقابل عصبي پوښونو کې ډیریږي.دا د AJ نیمګړتیا د CNCC ډیلیمینیشن کې د نیمګړتیا سره مطابقت لري، د AJ تحلیل ته اړتیا لري.برسېره پردې، د سپیک 11 تغیراتو د PI3K-AKT سیګنل کم کړی او اپوپټوسس زیات کړی.په ویټرو کې، په وحشي ډوله حجرو کې د PI3K-AKT سیګنال لږ مخنیوی د AJ بدلونونو هڅولو لپاره کافي و.په مهمه توګه، د AJ بدلونونه چې د SPECC1L دستک کولو لخوا هڅول شوي د PI3K-AKT لارې فعالولو سره بیرته راګرځیدلی شي.یوځای اخیستل شوي، دا ډاټا وړاندیز کوي چې SPECC1L، د PI3K-AKT سیګنالینګ او AJ بیولوژي د نوي تنظیم کونکي په توګه، د عصبي ټیوب بندولو او CNCC سټراټیفیکیشن لپاره اړین دی.
Cranial neural crest Cells (CNCCs) د ډورسل نیوروایکتوډرم ته ځای ورکوي او د پراختیایي عصبي فولډونو له نیوروپیتیلیم څخه د یوې پروسې له لارې جلا کیږي چې د اپیتیلیل - میسینچیمل لیږد (EMT) 1,2,3 شامل دي.د اپیتیلیل CNCCs پریمیګریشن د انټر سیلولر جنکشنونه ګډوډوي او د میسینچیمال CNCCs مهاجرت کوي چې د لومړي او دوهم فارینجیل آرچونه ډکوي او د کرینیوفیسیل کارټیلج ډیری برخه جوړوي.په دې توګه، هغه جینونه چې د CNCC فعالیت تنظیموي اکثرا د craniofacial زیږیدونکي اختلالاتو لکه orofacial clefts په etiology کې ګډوډ کیږي، په عمومي توګه یوازې په متحده ایالاتو کې د 1/800 زیږونونو اغیزه کوي.یو له زیږیدونکي نیمګړتیاو څخه 8.
د CNCC تخریب په موږکانو کې د جنین پراختیا د 8.5 او 9.5 ورځو ترمینځ د مخکینۍ عصبي ټیوب بندیدو سره مطابقت لري.د یو شمیر موږک orofacial cleft پورې تړلي جینونو تغیرات هم د عصبي ټیوب نیمګړتیا ځینې ډولونه نندارې ته وړاندې کوي، په شمول Irf69,10, Ghrl310, Cfl111، او Pdgfrα12.په هرصورت، د عصبي ټیوب بندولو پروسې او د CNCC سټراټیفیکیشن کولی شي خپلواک وګڼل شي، ځکه چې د Splotch mutant mouse (Pax3) د عصبي ټیوب په بندولو کې نیمګړتیاوې څرګندوي پرته له دې چې د CNCC سټریفیکیشن یا مهاجرت 13,14 باندې اغیز وکړي.د موږک اضافي ماډلونه چې د CNCC تحلیل او د عصبي ټیوب بندیدو کې نیمګړتیاوې لري د دې دوه پروسو عمومي مالیکولر اساس توضیح کولو کې مرسته کوي.
د نیوروپیتیلیل حجرو څخه د CNCC جلا کول د چپکونکي جنکشن (AJs) تحلیل ته اړتیا لري، کوم چې د پروټین کمپلیکسونو څخه جوړ شوي دي، د نورو په منځ کې، E-cadherin، β-catenin، α-E-catein، او α-actinin د actin filaments 2 سره تړاو لري. په عصبي پوښونو کې د E-cadherin Overexpression مطالعې د CNCC په ځنډ کې کمښت یا ځنډ ښودلی.برعکس، د E-cadherin فشار د ابتدايي جوړښت 15,16 پایله لري.ډیری فاکتورونه چې د CNCC د جوړښت په جریان کې د EMT منځګړیتوب کوي د لیږد فکتورونه دي (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) او extracellular matrix (ECM) بیا جوړونکي پروټینونه لکه میټریکس میټالوپروټینیز (MMPs) ، په هرصورت CNCCs مستقیم سایټوکولیټرونه دي. تر اوسه معلومه نه ده.د PI3K-AKT لاره د E-cadherin کچې سره د مقابلې لپاره پیژندل کیږي، په عمده توګه د سرطان څیړنې17 څخه.وروستیو څیړنو ښودلې چې په موږکانو کې د PDGFα-based PI3K-AKT سیګنلینګ ضایع کول د کرینیوفاسیل غیر معمولي حالتونو لامل کیږي ، پشمول د cleft palate او neural tube defects12.په هرصورت، د PI3K-AKT لارې او AJ ثبات ترمنځ اړیکه د CNCC سټراټیفیکیشن په اړه روښانه نده.
موږ دمخه SPECC1L په دوه خلکو کې د لومړي متغیر جین په توګه پیژندلی و چې د یوې سختې ټوټې سره چې د خولې څخه تر سترګو پورې غزیږي، د oblique cleft (ObFC) یا Tessier IV18 cleft په نوم پیژندل کیږي.د SPECC1L تغیرات په دوه څو نسلونو کورنیو کې د اوتوسومال غالب Opitz G/BBB سنډروم (OMIM # 145410) سره پیژندل شوي، په کوم کې چې اغیزمن شوي اشخاص د هایپر فاصله او د ټوټو شونډ / تالی 19 ښودل شوي، او په یوه کورنۍ کې د Tibi overdistance syndrome (OMIM #14202) .د Opitz G/BBB سنډروم له نیمایي څخه ډیر قضیې د ایکس سره تړلي دي (OMIM #300000) او د MID1 جین کې د تغیراتو له امله رامینځته کیږي، کوم چې د مایکروټیوبیل سره تړلې حجرې 22 پروټین انکوډ کوي.موږ فرض کوو چې SPECC1L، یو پروټین هم د مایکروټیوبونو او ایکټین سایټوسکلیټون سره تړاو لري، کیدای شي د حجرو د چپکولو او مهاجرت 18 په جریان کې د ایکټین سایټوسکلیټون بیا جوړونې لپاره اړین سیګنال منځګړیتوب وکړي.د ویټرو او ویوو مطالعاتو له لارې ، موږ اوس د PI3K-AKT سیګنالینګ له لارې د AJ ثبات د نوي تنظیم کونکي په توګه SPECC1L تشریح کوو.د حجرو په کچه، د SPECC1L کمښت د پان-AKT پروټین د کچې د کمښت او د AJ د apical-basal dispersion د زیاتوالي په پایله کې، چې د AKT لارې د کیمیاوي فعالولو له امله له منځه تللی و.په vivo کې، د Specc11-کمي جنین د عصبي ټیوب بندیدل او د CNCC تحلیل کم شوي ښیې.په دې توګه، SPECC1L د مخ د مورفوجینیزس په جریان کې د CNCC نورمال فعالیت لپاره په خورا تنظیم شوي حجرو اډیشن پراساس سیګنل کولو کې فعالیت کوي.
د سیلولر په کچه د SPECC1L رول مشخص کولو لپاره، موږ په SPECC1L18 کې د مخکینۍ بیان شوي مستحکم اوستیوسارکوما سیل لاین U2OS کمښت کارولی.دا مستحکم U2OS حجرې د SPECC1L (kd) دستک سره د SPECC1L لیږدونو او پروټینونو په کچه کې یو متوسط ​​(60-70٪) کمښت درلود، سره له دې چې د ایکټین سایټوسکلیټون 18 په مهاجرت او بیا تنظیم کولو کې نیمګړتیاوې شتون لري. SPECC1L ښودل شوي چې د مایټوټیک نیمګړتیاو لامل کیږي 23.د نورو ځانګړتیاوو په اړه، موږ وموندله چې زموږ باثباته SPECC1L-kd حجرې په خورا لوړې درجې سنگم کې مورفولوژي بدله کړه (شکل 1).د انفرادي کنټرول حجرې او kd حجرې په ټیټ ترکیب کې ورته ښکاري (شکل 1A,D).د فیوژن څخه 24 ساعته وروسته، د کنټرول حجرو خپل کیوبایډ شکل (انځور 1B، E) ساتلی و، پداسې حال کې چې د SPECC1L-kd حجرې اوږدې شوې (انځور 1C، F).د حجرو په شکل کې د دې بدلون حد د کنټرول حجرو او kd حجرو (فلم 1) د vivo ژوندی عکس العمل لخوا نیول شوی.په متضاد حجرو کې د SPECC1L رول ټاکلو لپاره، موږ لومړی د هغې څرګندونې معاینه کړې.موږ وموندله چې د SPECC1L پروټین کچه د فیوژن (شکل 1G) په وخت کې لوړه شوې، پداسې حال کې چې د SPECC1L لیږد کچه نه ده لوړه شوې (شکل 1H).برسېره پردې، لکه څنګه چې د حجرو کثافت زیات شوی، د SPECC1L پروټین د انټر سیلولر حدود (انځور 2A-E) کې راټول شوي، د جھلی پورې اړوند β-کیټینین (انځور 2A'-E') سره د نمونې سره یوځای کیږي.د ایکټین سایټوسکلیټون 18,23 سره د SPECC1L اړیکې ته په پام سره موږ داسې انګیرله چې SPECC1L د ایکټین پراساس چپکونکي جنکشن (AJ) سره اړیکه لري.
(AF) د SPECC1L دستګاه (DF) حجرې د کنټرول U2OS حجرو (AC) په پرتله په لوړ سنگم (F) کې اوږدیږي.دلته ښودل شوي د شپږو وخت ټکو څخه درې دي (T1, T3, T6) چې موږ د مختلف حجرو کثافت لپاره غوره کړي.(G) د لویدیځ بلاټ تحلیل ښیي چې د SPECC1L پروټین د کنټرول په حجرو کې د ټیټې درجې انفلاسیون په پرتله په لوړې درجې کې ثبات لري.د SPECC1L غربي بلاټ د متوقع 120 kDa بانډ او د لوړ مالیکولر وزن بډ ښیې ، ممکن د ژباړې وروسته ترمیم شوی (*).د لویدیځ بلټ تحلیل د ورته شرایطو لاندې د ټیټ او لوړ ترکیب لپاره ترسره شوی.هغه عکسونه چې SPECC1L په ټیټ او لوړ ترکیب کې ښیې له ورته بلاټ څخه اخیستل شوي.ورته داغ لرې شوی او د β-actin انټي باډي سره بیا معاینه شوی.(H) کمیتي RT-PCR تحلیل د SPECC1L لیږد کچه کې کوم مهم بدلون ندی ښودلی.د تېروتنې بارونه د څلورو خپلواکو تجربو څخه د SEMs استازیتوب کوي.
(AE) موږ شپږ وخت ټکي (T1-T6) غوره کړل چې د حجرو د کثافت لړۍ نمایندګي کوي ترڅو د حجرو شکل تحلیل نورمال کړي او په U2OS حجرو کې د SPECC1L دستک (kd) سره AJ بدلونونه.د دې وخت په لومړیو پنځو ټکو کې د واحد حجرو (T1)، د کوچنیو حجرو کلسترونو 50-70٪ فیوژن (T2)، د kd حجرو (T3) له شکل بدلولو پرته فیوژن، د kd حجرو (T4) بیا شکل کول، او د 24 ساعتونو بدلونونه شامل وو.د kd (T5) حجرو په وروسته شکل کې.د SPECC1L پروټین په عمده توګه په T1 (A) کې په سایټوپلازم کې توزیع شوی و، مګر د هغې جمع کول په راتلونکو وختونو (B-E، تیرونو) کې د انټر سیلولر حدود کې لیدل شوي.(FJ) β-catenin د AJ کمپلیکس سره تړلې د انټر سیلولر حدود کې ورته جمع ښیي.(A'-E') SPECC1L او β-catenin د حجرو په سرحدونو کې د لوړ حجرو کثافت (تیر) کې د اوورلیپ کولو داغ ښیې.(F'-J') په SPECC1L-kd حجرو کې، د β-کیټینین داغونه د ټیټ حجرو کثافت (F'-H') کې نورمال ښکاري، مګر د حجرو د شکل بدلون (I', J'؛ تیر) په څیر پراخیږي، دا په ګوته کوي چې AJ بدل شوي دي.بار = 10 µm.
بیا موږ هڅه وکړه چې په AJ باندې د SPECC1L کمښت اغیز وټاکو.موږ ډیری AJ پورې تړلي مارکرونه کارولي، پشمول د کانونیکي اجزاو F-actin، myosin IIb، β-catein، او E-cadherin24,25,26,27.د ایکټین فشار فایبر په SPECC1L-kd حجرو کې ډیر شوي لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي (انځور 3A,B) 18.Myosin IIb د actin filaments سره تړاو لري په ویټرو کې د SPECC1L-kd حجرو کې ورته زیاتوالی ښودلی (انځور 3C،D).د AJ پورې تړلی β-catein د حجرو په غشا کې د کیډیرین سره تړلی دی، د کنټرول کیوبوسایټونو کې د عادي "شاتو" څرګندولو نمونه ښیي (انځور 3E،G).په زړه پورې، په فلیټ عکسونو کې د کنفوکال مایکروسکوپي په کارولو سره، β-catenin (Fig. 3E,F) او E-cadherin (Fig. 3G,H) د SPECC1L کمښت حجرو د حجرو غشا باندې داغونه د اوږد شوي داغونو څرګند نمونې ښودلې.د Kd په حجرو کې د AJ سره تړلي β-catein داغ دا پراخیدل په سنگم کې خورا څرګند و، مګر د حجرو په شکل کې د بدلون څخه مخکې ښکاري (انځور 2F-J، F'-J').د دې غزیدلي AJ داغونو فزیکي نوعیت معلومولو لپاره، موږ د SPECC1L-kd U2OS حجرو په apical-basal سطح کې د لیږد بریښنایی مایکروسکوپي (TEM) (شکل 3I، J) لخوا د حجرو سرحدونه معاینه کړل.د کنټرول حجرو (Fig. 3I) په مقابل کې، چې د AJ (تیرونو) جلا جلا الکترون کثافت سیمې یې درلودې، kd حجرې (انځور 3J) د اپیکوباسال الوتکې په اوږدو کې د AJ د لوړ الکترون کثافت شاخص لوی، سره تړلې سیمې ښودلې..برسېره پردې، په انتقالي برخو کې، موږ په kd حجرو کې د حجرو غشا پراخ پوښونه ولیدل (انځور. S1A,B)، کوم چې د β-catenin او E-cadherin سټینینګ بانډونو (انځور 3F، H) پراخ شوي نمونې تشریح کوي.په AJs کې د SPECC1L رول په ملاتړ کې، β-catenin د SPECC1L سره په ګډه د U2OS حجرو په لیسټس کې په ګډه معافیت شوی و (انځور 3K).د AJ مارکرانو لپاره د معافیت پراخولو سره، د TEM تحلیل زموږ د فرضیې سره مطابقت درلود چې د SPECC1L کمښت د AJ apical-basal کثافت او توپیر زیاتوي.
(AH) د فیوژن څخه وروسته په 48 ساعتونو کې د kd حجرو کې د F-actin داغ زیاتوالی (T6; A, B).د myosin IIb بدل شوی داغ د F-actin (C,D) سره تړاو لري.د کنټرول حجرو (E، G) کې د β-catenin او E-cadherin جھلی داغونو نرمه نمونه د SPECC1L-kd (F، H) حجرو کې وده شوې.بار = 10 µm.(I-J) الکترون مایکروګرافونه د apical-basal intercellular junction مشاهده کوي.د کنټرول حجرې جلا جلا الکترون لرونکې سیمې ښیي چې چپچینې جنکشنونه (I، تیر) په ګوته کوي.په مقابل کې، په SPECC1L-kd حجرو کې ټول apical-basal junction د الکترون کثافت (J, arrows) ښکارېدل، چې د چپکونکو جنکشنونو د کثافت او خپریدو زیاتوالی په ګوته کوي.(K) β-catenin د SPECC1L سره په ګډه U2OS سیل لیسټس کې په ګډه معافیت شوی.انځور له یوه ځای څخه اخیستل شوی چې د څلورو خپلواکو تجربو استازیتوب کوي.
د کرینیوفاشیل مورفوګینسیس کې د SPECC1L رول د پوهیدو لپاره، موږ د دوه خپلواک ES ټراپ سیل لاینونو، DTM096 او RRH048 (BayGenomics، CA) په کارولو سره د سپیک 1 ایل نیمګړتیا ماوس ماډل رامینځته کړ، کوم چې د انټرون 1 استازیتوب کوي او د سپیک 1 ایل لیږدونه په Fig15 کې نیول شوي. .4A، شکل S2).د ډیکوی ویکتور داخلولو جینومیک موقعیت د ټول جینوم ترتیب لخوا ټاکل شوی او د PCR (انځور S2) لخوا تایید شوی.د جین جال دواړه ډیزاین هم د نیول کیدو وروسته د Specc11-lacZ خبریالانو په چوکاټ کې فیوژن ته اجازه ورکړه.له همدې امله، د X-gal سټینینګ لخوا ټاکل شوی lacZ بیان د Specc11 بیان شاخص په توګه کارول شوی.دواړه ایلیلونه د ورته lacZ بیان نمونې وښودلې، په انټرون 1 کې د DTM096 جین جال سره په انټرون 15 کې د RRH048 په پرتله قوي څرګندونه ښیې (نه ښودل شوي).په هرصورت، Specc1l په پراخه کچه څرګند شوی، په ځانګړې توګه په E8.5 (شکل 4B) کې د عصبي پوښونو کې، په E9.5 او E10.5 (شکل 4C،D) کې د عصبي ټیوب او د مخ پروسو کې، او د غړو په وده کې. په E10 کې.5 او سترګې (انځور 4D).موږ مخکې راپور ورکړی و چې د SPECC1L څرګندونه په E10.5 کې په لومړي فیرینجیل آرچ کې په اپیتیلیم او لاندې mesenchyme18 کې شتون درلود ، د CNCC نسب سره مطابقت لري.په CNCC کې د SPECC1L بیان ازموینې لپاره، موږ د E8.5 عصبي فولډ (شکل 4E-J) او د E9.5 د پوستکي برخې (شکل 4K-) ترسره کړې.په E8.5 کې، SPECC1L په شدت سره د عصبي فولډ داغونه (انځور 4E، H)، په شمول د NCC مارکرونو سره داغ شوي حجرې (انځور 4G، J).په E9.5 کې، SPECC1L (انځور. 4K، N) د AP2A (انځور 4L، M) یا SOX10 (انځور 4O، P) سره په ګډه د سی این سی سی د مهاجرت سخت داغ.
(A) د موږک Specc11 جین سکیماتیک نمایش په ES DTM096 (Intro 1) او RRH048 (intron 15) حجرو کلونونو کې د ډیکو ویکتور داخلول ښیې.(BD) د heterozygous Specc1lDTM096 جنینونو lacZ داغونه چې د E8.5 څخه تر E10.5 پورې د Specc1l بیان څرګندوي.NE = neuroectoderm، NF = neural fold، PA1 = لومړی pharyngeal arch.(EP) د E8.5 (NF؛ EJ) عصبي فولډونو او E9.5 (KP) د کوپړۍ برخو کې د NCC مارکر AP2A او SOX10 سره SPECC1L معافیت.د SPECC1L داغونه په پراخه کچه په عصبي فولډونو E8.5 (E, H; arrowheads) کې لیدل شوي، په شمول د AP2A (F, G; تیر سرونو) او SOX10 (I, J؛ تیر سرونو) سره لیبل شوي حجرې.په E9.5 کې، SPECC1L په کلکه د مهاجرت CNCCs (K, N; تیرونه) د AP2A (L, M; تیرونو) او SOX10 (O, P; تیر) لیبل شوي.
د هیټروزایګوس Specc1lDTM096/+ او Specc1lRRH048/+ موږکانو ترمنځ تیریدل ښیي چې دوه جین ټریپ ایلیلونه بشپړونکي ندي او د هیټروزایګوټس او جنین هوموزایګوټس مرکبات د جین ټریپ ایلیل لپاره جنین وژونکي دي (جدول S1).د مینډیلین تناسب د زیږون په وخت کې د هیټروزایګوټس د ژوندي پاتې کیدو کچه کې کمښت په ګوته کوي (تقسیم 1.34 vs. 2.0).موږ د هیټروزایګوټس په مینځ کې د زیږون پرمهال د مړینې ټیټه یادونه وکړه، ځینې یې د کرینیوفاشیل بې نظمۍ درلودې (انځور S3).په هرصورت، د دې perinatal craniofacial phenotypes ټیټ نفوذ دا ستونزمن کوي ​​​​چې د دوی اصلي رنځپوهنې میکانیزمونه مطالعه کړي.له همدې امله، موږ د هوموزائګس سپیک 11 میوټینټ جنین وژونکي فینوټایپ باندې تمرکز وکړ.
ډیری مرکب هیټروزایګوس یا هوموزایګوس Specc1lDTM096/RRH048 متغیر جنینونه د E9.5–10.5 (انځر 5A-D) وروسته وده نه کوي، او عصبي ټیوب په مخکینۍ توګه نه و تړل شوی (انځر. 5B, D) او ځینې وختونه وروسته تړل شوي (نه ښودل شوي) ..دا د کرینیل عصبي ټیوب بندیدو نیمګړتیا د CNCC ډیری نښه شوي DLX2 سره تړلې وه چې په E10.5 کې په عصبي فولډونو کې پاتې دي ، چې هیڅ تحلیل نه په ګوته کوي (شکل 5A'-D').د دې لپاره چې معلومه کړي چې آیا د CNCC مجموعي اندازه هم کمه شوې وه، موږ د CNCC لینونه د GFP سره زموږ د جین ټریپ لاینونو کې د Wnt1-Cre او ROSAmTmG سره ټګ کړل.موږ د ټولو جنینونو څخه ترتیب شوي GFP+ NCC او GFP- (RFP+) غیر NCC جریان کوو.په E9.5 کې، د جریان ترتیب شوي GFP لیبل شوي CNCCs تناسب د WT او متغیر جنینونو ترمنځ د پام وړ بدلون نه دی راغلی (نه ښودل شوی)، د CNCC نورمال مشخصات په ګوته کوي.له همدې امله، موږ داسې انګیرنه وکړه چې په ښکاره شوي عصبي فولډونو کې د پاتې Wnt1-Cre او DLX2 داغونه (انځور 5B') د CNCC د عیب له امله و، ممکن د AJ حجرو د کثافت یا خپریدو له امله وي، لکه څنګه چې په SPECC1L-kd حجرو کې لیدل کیږي.موږ د NCC نښه کونکي SOX10، AP2A، او DLX2 کارولي ترڅو په عصبي پوښ کې د CNCC شتون تایید کړي (شکل 5E-R).په E8.5 کې، د ټولو دریو NCC مارکرونو لپاره د عصبي فولډ داغ د WT (انځور 5E، G، I) او Specc1l متغیر (انځور 5F، H، J) برخو کې لیدل شوي.په E9.5 کې، پداسې حال کې چې د NCC مارکرانو د WT برخو (Fig. 5M, O, Q) کې د مهاجرت NCC داغونه، د NCC د پاتې کیدو د Specc1l متغیر جنینونو (انځور 5N, P, R) په ښکاره شوي عصبي پوښونو کې لیدل شوي.ځکه چې SOX10 او DLX2 د CNCCs مهاجرت نښه کوي، دا پایله وړاندیز کوي چې د SPECC1L کمښت لرونکي CNCCs د مهاجرت وروسته مشخصات ترلاسه کوي مګر د عصبي پوښونو څخه په مهاجرت کې پاتې راغلي.
د Specc11 کمښت د عیب لرونکي عصبي ټیوب بندیدو ، د کرینیل عصبي کریسټ حجرو او AJs تخریب لامل کیږي.
(A, B') E9.5 WT (A) جنین چې د مهاجرت د کرینیل عصبي کریسټ حجرو (CNCC) لیږدوي د Wnt1-Cre (A') سره لیبل شوی.په مقابل کې، Specc11 متغیر جنینونه خلاص عصبي فولډونه (B)، تیر سرونه) او CNCCs چې مهاجرت شوي ندي (B'، تیر سرونه).(C, D') روښانه ساحې انځورونه (C, D') او د CNCC مارکر DLX2 د E10.5 WT جنینونو (C, C') او Specc1l (D, D') معافیت (C', D').په WT E10.5 جنینونو کې، DLX2-مثبت CNCC د ګیل آرچ (C'، تیر) استعمار کوي، پداسې حال کې چې په متقابلو کې، ښکاره داغونه په خلاص عصبي فولډونو (D'، تیرونو) کې دوام لري او په لومړي فیرینجیل آرچ (D'، تیر).) د ځینو داغونو سره (تیر) د CNCC ضعیف ډیلیمینیشن او مهاجرت په ګوته کوي.ER) د WT او Specc1l متغیر جنین برخې په E8.5 (E-L) او E9.5 (M-R) مرحلو کې د NCC مارکر SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,) سره لیبل شوي. O, P) او DLX2 (I, J, Q, R).په E8.5 کې، د NCC داغونه په وحشي ډوله عصبي فولډ (NF) او متغیر برخو کې لیدل شوي.په E8.5 WT (K) او mutant (L) کې د SOX10 او β-catenin ګډ رنګ د عصبي فولډونو کې د حجرو په حدودو کې د β-catenin داغ ډیروالی په ګوته کوي.په E9.5 کې، د مهاجرت CNCCs (M, O, Q) وحشي ډوله داغ لیدل شوي، پداسې حال کې چې په متقابلو کې، غیر منظم شوي CNCCs د خلاص عصبي فولډ (N, P, R) داغ لري.(S-Z) د WT او Specc11DTM096/RRH048 جنینونو د E9.5 بدلون سره د کورونل برخو کې د vivo AJ لیبل کولو تحلیل.په پورتنۍ ښیې کونج کې نږدې برخه لرونکي الوتکه ښودل شوې.د متغیر نسجونو په برخو کې، د F-actin (S, T) او myosin IIb (U, V) زیاتوالی لیدل شوی.د ویټرو پایلو په څیر په 3 شکل کې، په متغیر جنینونو کې، د β-catenin (W, X) او E-cadherin (Y, Z) لپاره د غشا لوړ شوي داغ لیدل شوي.(AA-BB) د وحشي ډوله جنین د یوې برخې الکترون مایکروګراف چې د apical-basal حجرې له پولې هاخوا ګوري د جلا بریښنایی کثافاتو سیمه ښیي چې د چپکونکو جنکشنونو شاخص (AA، تیر).برعکس، د Specc11 متغیر جنینونو (BB، تیر) برخو کې، د اپیکوباسال بشپړ جنکشن د الکترون کثافت دی، چې د چپکونکو جنکشنونو زیاتوالي او خپریدو په ګوته کوي.
زموږ د فرضیې ازمایښت لپاره چې د پرتونو کموالی د بدل شوي AJ له امله دی، موږ د Specc1l متغیر جنینونو (Fig. 5S-Z) په ښکاره شوي عصبي فولډونو کې د AJ لیبلینګ معاینه کړه.موږ د ایکټین فشار فایبرونو (انځور 5S, T) کې زیاتوالی لیدلی او د یوټین فایبرونو (انځور 5U, V) کې د مایوسین IIB داغونو ځایی کولو سره یوځای زیاتوالی لیدلی.په مهمه توګه، موږ د β-catenin (Fig. 5W,X) او E-cadherin (Fig. 5Y,Z) په انټر سیلولر سرحدونو کې د داغ زیاتوالی لیدلی.موږ د E8.5 جنینونو (انځور 5K، L) په عصبي فولډونو کې د NCC د β-catein داغ هم معاینه کړه.د β-catenin داغونه په Specc1l mutant neural folds (Fig. 5L او K) کې پیاوړي ښکاري، دا وړاندیز کوي چې د AJ بدلونونه پیل شوي.د E9.5 جنینونو د کوپړۍ د برخو الکترون مایکروګرافونو کې، موږ بیا د WT (انځور 5AA، BB او S1E-H) په پرتله په Specc1l متغیر جنینونو کې د ډیفوز الیکټرون کثافت داغونه ولیدل.په ګډه اخیستل شوي، دا پایلې د SPECC1L-kd U2OS حجرو کې زموږ د ویټرو پایلو مالتړ کوي او وړاندیز کوي چې د AJ غیر معمولي داغ زموږ په متغیر جنینونو کې د CNCC سټراټیفیکیشن څخه مخکې وي.
د AKT فعالیت او د E-cadherin ثبات ترمنځ پیژندل شوي ضد اړیکو ته په پام سره، 17,28 موږ د PI3K-AKT سیګنالینګ ښکیلتیا فرض کړه.برسېره پر دې، موږ زموږ په ځینو متغیر جنینونو کې د subepidermal ټوخی لیدلي چې په E9.5-10.5 کې وژونکي (<5%) څخه تښتیدلي او پرځای یې شاوخوا E13.5 (انځور S3) کې میشته شوي.Subepidermal vesicles د PDGFRα12 پر بنسټ د کم شوي PI3K-AKT سیګنالینګ نښه ده.Fantauzzo et al.(2014) راپور ورکړی چې په PdgfraPI3K/PI3K متغیر جنینونو کې د PDGFRα پر بنسټ د PI3K فعالیت ګډوډ د subepidermal vesicles، د عصبي ټیوب نیمګړتیاو، او cleft palate phenotypes پایله لري.په حقیقت کې، د pan-AKT او فعال فاسفوریلیټ Ser473-AKT کچه په Vivo کې د Specc1l متغیر نسجونو کې E9.5 جنین نیول (انځور 6A-D) ته کمه شوې.د فاسفوریلیټ Ser473-AKT په کچه کې کمښت ممکن په بشپړ ډول په vivo (FIG. 6E) او in vitro (FIG. 6F) کې د pan-AKT د کچې د کمښت له امله وي.د ویټرو کمښت یوازې هغه وخت لیدل شوی کله چې د U2OS حجرې د حجرو په شکل او د AJ کثافت (شکل 6D) کې د بدلونونو سره په کلکه یوځای شوي.په دې توګه، زموږ ډاټا وړاندیز کوي چې SPECC1L د PI3K-AKT سیګنال کولو نوی مثبت تنظیم کونکی دی چې په کرینیوفیسیل مورفوګینسیس کې دی.
(A-E) E8.5 (A,B) او E9.5 (C,D) د کوپړۍ برخې یا E9.5 lysates د Specc1l متغیر جنین (E) څخه د فعال فاسفوریلیټ S473-AKT او pan-AKT پروټین کمښت ښیي د کنټرول WT په پرتله.لویدیځ بلوټینګ په ورته شرایطو کې په وحشي ډوله لیزیټ او میوټینټ لیزیټس باندې ترسره شوی.د SPECC1L لپاره ښودل شوي عکسونه د یو بلاټ څخه اخیستل شوي.ورته داغ لرې شوی او د انټي پین-ACT او β-actin انټي باډیز سره بیا معاینه شوی.د E8.5 عصبي فولډونو (A, B) کې د Pan-AKT کچه او د E9.5 د پوستکي په برخو کې د فاسفوریلیټ S473-AKT کچه د پام وړ کمه شوې.(F) د پان-AKT کچه په ورته ډول د SPECC1L-kd U2OS حجرو په لیسټس کې کمه شوې وه چې په لوړ ترکیب کې راټول شوي.د خطا بارونه د دریو خپلواکو لویدیځ بلاټ مقدارونو څخه SEMs استازیتوب کوي.(GJ) په E9.5 کې د WT جنین برخې په ترتیب سره د KI67 او cleaved caspase 3 سره داغ شوي، د حجرو پراختیا (G, G') او لږ اپوپټوټیک فعالیت (H, H').Specc11 متغیر جنینونه د پرتلې وړ حجرو پراخوالی (I) ښیي، مګر د اپوپټوسس لاندې د حجرو شمیر د پام وړ زیات شوی (J).
موږ بیا د خپریدو او اپوپټوسس مارکرونه معاینه کړل.موږ د E9.5 جنینونو (I په پرتله انځور 6E، G) په خپریدو کې کوم توپیر نه دی لیدلی چې د خپریدو شاخص د WT میوټینټ لپاره 82.5٪ او د Specc1l mutants لپاره 86.5٪ د KI67 سټینینګ لخوا اندازه شوی (p <0.56، فشرز دقیق ازموینه).په ورته ډول، موږ په E8.5 کې په عصبي فولډونو کې د کلیوډ کیسپیس 3 لپاره د داغ په واسطه اندازه شوي اپوپټوسس کې هیڅ توپیر ونه لید تر هغه چې د جنین نیول (نه ښودل شوي) (نه ښودل شوي).په مقابل کې، اپوپټوسس په ټولو E9.5 متغیر جنینونو کې د پام وړ زیاتوالی موندلی (انځور 6F، H او J).په اپوپټوسس کې دا ټولیز زیاتوالی د PI3K-AKT سیګنل کمولو او د جنین لومړني مړینې 29,30,31 سره مطابقت لري.
بیا، زموږ په kd حجرو کې د AJ بدلونونو کې د PI3K-AKT سیګنالینګ لپاره د لامل رول تایید کولو لپاره، موږ په کیمیاوي ډول د کنټرول او kd حجرو کې لاره بدله کړه (شکل 7A-F).موږ د مارکر په توګه د حجرو د شکل بدلون فینوټایپ د SPECC1L-kd حجرو کې لیدل شوي د مارکر په توګه وکاروو، کوم چې موږ د ورته عمودی ابعاد (پلورل) سره د ترټولو اوږد ابعاد (لږوالی) تناسب په کارولو سره اندازه کړې.د نسبتا ګردي یا کیوبایډل حجرو لپاره د 1 تناسب تمه کیږي (شکل 7G).د حجرو د شکل سربیره، موږ د β-catenin سټینګ (انځور 7A'-F') لخوا په AJ باندې اغیزه هم تایید کړه.د wortmannin په کارولو سره د PI3K-AKT لارې مخنیوی د کنټرول حجرو (شکل 7A,C) او AJ (شکل 7A) کې د حجرو شکل بدلولو لپاره کافي و.PI3K-AKT فعالونکي SC-79 د کنټرول حجرو کې د حجرو شکل (FIG. 7A, E) یا د AJ توسیع (FIG. 7A') اغیزه نه کوي.په SPECC1L-kd حجرو کې، د PI3K-AKT لارې نور فشار د apoptosis زیاتوالي (انځور 7B,D) او د β-کیټینین سټیننګ (انځور 7B') کې د پام وړ زیاتوالی لامل شوی ، چې زموږ د vivo درنو میوټینټونو سره مطابقت لري.په مهمه توګه، د PI3K-AKT لارې فعالول د پام وړ د حجرو شکل (شکل 7B,F) او AJ فینوټایپونه (شکل 7B") ښه کړي.د حجرو په شکل کې بدلونونه د حجرو د ګردوالي تناسب (CCR) په توګه اندازه شوي او د اهمیت لپاره پرتله شوي لکه څنګه چې پورته تشریح شوي (FIG. 7G).په حقیقت کې، د کنټرول په حجرو کې (انځور 7G، CCR = 1.56)، د وورتمینین درملنه کافي وه چې د پام وړ د حجرو شکل بدل کړي (انځور 7G، CCR = 3.61، p <2.4 × 10-9) تر هغه حد پورې چې لیدل شوي. په SPECC1L کې.-kd حجرې (انځور 7G، CCR = 3.46).د SPECC1L-kd حجرو د Wortmannin درملنه (Fig. 7G, CCR = 3.60, negligible) د درملنې نه شوي kd حجرو (انځور 7G, CCR = 3.46، نه منلو وړ) یا د wortmannin درملنه شوي کنټرول حجرو (انځور 7G) څخه ډیر مهم نه و., CCR = 3.46, negligible) سربیره پردې د حجرو اوږدوالی اغیزه کوي (7G, CCR = 3.61, negligible).تر ټولو مهم، د SC-79 AKT فعال کونکي د SPECC1L-kd حجرو اوږده فینوټایپ بحال کړ (انځور. 7G، CCR = 1.74، p <6.2 × 10-12).دا پایلې تاییدوي چې SPECC1L د PI3K-AKT سیګنال تنظیموي او وړاندیز کوي چې په SPECC1L کې اعتدال کمښت د حجرو په چپکولو اغیزه کوي، پداسې حال کې چې قوي کمښت د اپوپټوسس لامل کیږي (انځور 8).
(A-F') کنټرول (A, C, E) او د SPECC1L-kd (B, D, F) حجرې د PI3K-AKT د لارې مخنیوی کونکي وورتمنین (C, D) یا SC-79 فعالونکي (E, F) درملنه .د نه درملنه شوي کنټرول حجرې د کیوبایډل (A) سره د نورمال β-cat سیلولر داغ (A') سره دي، پداسې حال کې چې kd حجرې د β-cat د داغونو (B') زیاتوالي سره اوږد شوي (B) دي.د PI3K-AKT لارې د فشار وروسته، د کنټرول حجرې د β-cat توسیع (C') سره اوږدې شوې (C)، پداسې حال کې چې د kd حجرو د اپوپټوسس (D) څخه تیریدل پیل کړل، زموږ د لوړ بدل شوي جنینونو په څیر او خورا لوړ شوي β-cat ښیې.داغ ورکول (D').د PI3K-AKT لارې له فعالولو وروسته، د کنټرول حجرې کیوبایډال (E) پاتې شوې او نورمال β-cat (E') داغ لري، پداسې حال کې چې د kd حجرو د پام وړ د حجرو شکل (F) او β-cat (F') داغ ښیې، چې دا په ګوته کوي (G) په (AF) کې د حجرې د شکل بدلون درجه د میټا مورف سافټویر په کارولو سره د حجرو ګردوالي تناسب (CCR) تر ټولو اوږد ابعاد (اوږدوالی) او ورته عمودی ابعاد (چوک) په کارولو سره اندازه شوې.نه درملنه شوي (NT) SPECC1L-kd حجرې (CCR = 3.46) د کنټرول حجرو څخه د پام وړ اوږدې وې (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).د کنټرول په حجرو کې د PI3K-AKT لارې د Wort مخنیوی کافي و چې د حجرو په شکل کې ورته اوږدوالی رامینځته کړي (CCR=3.61, p<2.4×10-9).په ورته ډول، په SPECC1L-kd حجرو کې د SC-79 لخوا د AKT فعالول د کنټرول کچې ته د حجرو اوږدوالی بیرته راګرځوي (CCR = 1.74، p <6.2 × 10-12).د SPECC1L-kd حجرو د Wortmannin درملنه د اپوپټوسس د زیاتوالي په پایله کې رامینځته شوې مګر د غیر درملنې شوي kd (CCR=3.46, ns) یا wortmannin درملنې شوي کنټرول حجرو (3.61) په پرتله د حجرو شکل بدلون (CCR=3.60) کې نور زیاتوالی ندی لیدل شوی.ns = مهمه نده.+/- د 50 حجرو لپاره د SEM اندازه ښودل شوي.احصایوي توپیرونه د زده کونکي د ټیسټ په کارولو سره محاسبه شوي.
(A) د PI3K-AKT لارې د مخنیوي او فعالولو سکیمیک نمایش چې په ترتیب سره د AJ بدلون او ژغورنې لامل کیږي.(B) د SPECC1L لخوا د AKT پروټین ثبات لپاره وړاندیز شوی ماډل.
پریمیګریټی CNCCs AJ lysis ته اړتیا لري ترڅو د مخکینۍ عصبي فولډ نیوروپیتیلیل حجرو څخه جلا شي 1,15,32.د AJ اجزاو د داغونو زیاتوالی او د SPECC1L کمښت حجرو کې د apical-basal AJ غیر متناسب توزیع له لاسه ورکول دواړه په vitro او vivo کې ، د SPECC1L فزیکي نږدېوالي سره β-catein سره یوځای ، وړاندیز کوي چې SPECC1L د AJ محلي ثبات په سمه توګه ساتلو لپاره فعالیت کوي. تنظیمي عضلات.actin cytoskeleton.د ایکټین سایټوسکلیټون او β-کیټینین سره د SPECC1L اړیکه او د SPECC1L په نشتوالي کې د کنډنس شوي ایکټین فلامینټونو شمیر کې زیاتوالی د AJ کثافت کې د لیدل شوي زیاتوالي سره مطابقت لري.بل احتمال دا دی چې د SPECC1L کمښت حجرو کې د ایکټین فایبرونو زیاتوالی د انټر سیلولر فشار کې بدلون لامل کیږي.ځکه چې د سیلولر فشار د AJ 33 متحرکات اغیزه کوي، د ولتاژ بدلونونه کولی شي د AJ 34 ډیر توزیع المل شي.نو هر ډول بدلون به د CNCC پرتونو اغیزه وکړي.
Wnt1 په لومړیو عصبي فولډونو کې څرګند شوی چې د عصبي کریسټ حجرو ته وده ورکوي.په دې توګه، د Wnt1-cre نسب تعقیب دواړه NCC35 مخکې او مهاجرت نښه کوي.په هرصورت، Wnt1 د دماغي نسجونو کلونونه هم په نښه کوي چې د ابتدايي عصبي فولډ 35,36 څخه اخیستل شوي، دا احتمال رامینځته کوي چې په خلاص عصبي فولډونو کې د Wnt1 مارکرونو لپاره زموږ د E9.5 میوټینټ داغ CNCC نه وي.د NCC نښه کونکو AP2A او SOX10 لپاره زموږ مثبت داغ تایید کړه چې د سپیک 11 متغیر جنینونو افشا شوي عصبي فولډونه واقعیا CNCC لري.برسېره پردې، څرنګه چې AP2A او SOX10 د NCC د ابتدايي مهاجرت نښه کونکي دي، مثبت داغونه په ګوته کوي چې دا حجرې د مهاجرت څخه وروسته CNCC دي چې نشي کولی د E9.5 لخوا تنظیم شي.
زموږ ډاټا وړاندیز کوي چې د SPECC1L لخوا د AJ مالیکولر مقررات د PI3K-AKT سیګنالینګ لخوا منځګړیتوب کیږي.د AKT سیګنالینګ د SPECC1L کمښت حجرو او نسجونو کې کم شوی.د Fantauzzo et al لخوا موندنې.د PI3K-AKT سیګنالینګ لپاره د کرینیوفیسیل مورفوګینسیس کې مستقیم رول ملاتړ کوي.(2014) وښودله چې د PDGFRα-based PI3K-AKT سیګنالینګ د فعالولو نشتوالی د خال خال فینوټائپ لامل کیږي.موږ دا هم ښیو چې د PI3K-AKT لارې مخنیوی د U2OS حجرو کې د AJ او حجرو شکل بدلولو لپاره کافي دی.زموږ د موندنو سره مطابقت، Cain et al.37 وښودله چې په Endothelial حجرو کې د PI3K α110 سبونیټ ټیټ تنظیم د پیری سیلولر β-کیټینین داغ کې د ورته زیاتوالي لامل کیږي ، چې د "اړیکو شاخص" کې د زیاتوالي په توګه راجع کیږي.په هرصورت، په Endothelial حجرو کې چې د ایکټین فلامینټونه دمخه خورا تنظیم شوي، د PI3K-AKT لارې فشار د یو نرم حجرو شکل پایله لري.په مقابل کې، د SPECC1L-kd U2OS حجرو د حجرو اوږد شکل ښودلی.دا توپیر ممکن د حجرو ډول مشخص وي.پداسې حال کې چې د PI3K-AKT سیګنلینګ فشار د تل لپاره د ایکټین سایټوسکلیټون اغیزه کوي ، د حجرو په شکل اغیزه د مرکزي ایکټین فایبرونو کثافت او تنظیم کې د بدلون له امله رامینځته شوي فشار کې بدلونونو لخوا ټاکل کیږي.په U2OS حجرو کې، موږ یوازې د حجرو شکل بدلونونه د SPECC1L-کموالی AJ بدلون او بیا رغونې نښه کونکي په توګه کارولي.په پایله کې، موږ فرض کوو چې د SPECC1L کمښت کې د AKT لارې مخنیوی د AJ ثبات زیاتوي او په CNCC کې ډیلمینشن کموي.
په زړه پورې خبره دا ده چې د SPECC1L په نشتوالي کې د فاسفوریلیټ 473-AKT کچې سربیره په ویټرو او ویوو کې د پین-AKT کچه راټیټه شوې ، د AKT پروټین ثبات یا بدلون په کچه د PI3K-AKT سیګنال تنظیم کولو وړاندیز کوي.د SPECC1L او MID1 جینونه، دواړه د Opitz/GBBB سنډروم سره تړاو لري، پروټینونه انکوډ کوي چې د مایکروټیوبونو 18,22 ثبات کوي.هغه میکانیزم چې له مخې یې SPECC1L او MID1 د مایکروټیوبیل ثبات منځګړیتوب کوي په بشپړ ډول نه پوهیږي.د SPECC1L په حالت کې، پدې ثبات کې د مایکروټیوبونو 18 فرعي سیټ لوړ شوی اکیتیلیشن شامل دی.دا ممکنه ده چې SPECC1L د نورو پروټینونو لکه AKT ثبات لپاره ورته میکانیزم کاروي.دا ښودل شوي چې د AKT پروټین کې د لیسین د پاتې شونو اکیتیلیشن د جھلی د ځایی کولو او فاسفوریلیشن 38 کمیدو لامل کیږي.برسېره پردې، په AKT کې د ورته لیسین پاتې شونو کې د K63 سلسله هر اړخیزه کول د هغې د غشا ځایی کولو او فعالولو لپاره 39,40 ته اړتیا لري.د SPECC1L پروټینونو سره متقابل عمل د ډیری فکتورونو په مینځ کې چې په مختلف لوړ ټرپوټ خمیر دوه هایبرډ سکرینونو کې پیژندل شوي ، څلور - CCDC841, ECM2942, APC او UBE2I43 - د هر اړخیز یا سمویلیشن له لارې د پروټین بدلون یا ثبات کې ښکیل شوي.SPECC1L ممکن د AKT lysine پاتې شونو د ژباړې وروسته ترمیم کې ښکیل وي، چې د AKT ثبات اغیزه کوي.په هرصورت، د AKT پروټین ځایی کولو او ثبات کې د SPECC1L مهم رول باید روښانه شي.
په vivo کې د SPECC1L اظهار کې شدیدې نیمګړتیاوې د AJ مارکر داغونه او د CNCC عیب پوښښ، او همدارنګه د اپوپټوسس زیاتوالی او د جنین لومړني مړینې لامل شوي.پخوانیو راپورونو ښودلې چې د اپوپټوسس د کچې د زیاتوالي سره د موږک بدلونونه د عصبي ټیوب نیمګړتیاو 44,45,46,47 او craniofacial عیبونو48 سره تړاو لري.دا وړاندیز شوی چې په عصبي فولډونو یا فارینجیل آرچونو کې د حجرو ډیر مړینه ممکن د مناسب مورفوجینیک حرکت 48,49,50 لپاره اړین حجرو ناکافي شمیر لامل شي.په مقابل کې، زموږ د SPECC1L کمښت حجرې لاینونه د معتدل کم شوي SPECC1L بیان سره یوازې د AJ بدلونونه ښودلي پرته له دې چې د حجرو د مړینې زیاتوالي شواهد.په هرصورت، په دې Kd حجرو کې د PI3K-AKT لارې کیمیاوي مخنیوی د اپوپټوسس زیاتوالي پایله درلوده.په دې توګه، د SPECC1L بیان یا فعالیت کې منځنۍ کمښت د حجرو بقا تضمینوي.دا د هغه مشاهدې سره مطابقت لري چې نادر Specc11 متغیر جنینونه چې په سینټ کې له نیول کیدو تښتي.E9.5—شاید د جین د نیولو د موثریت د کموالي له امله—د دې وړتیا لري چې خپل عصبي ټیوبونه وتړي او وروسته د پراختیا په حال کې ودروي، ډیری وختونه د کرینیوفاشیل نیمګړتیاو سره (انځور S3).له دې سره همغږي د هیټروزیګوس سپیک 1 ایل جنینونو نادره پیښې د کرینیو فاسیل غیر معمولي پیښو سره - شاید د جین نیول کیدو موثریت زیاتوالي له امله - او همدارنګه په زیبرا فش کې موندنه چې په هغه کې د دوه SPECC1L اورتولوګونو څخه یو (specc1lb) د لیټرو فینشیل د ضایع کیدو لامل کیږي. ښکته ژامې او دوه اړخیزې ټوټې 51.په دې توګه، د هیټروزایګوس SPECC1L د فعالیت له لاسه ورکولو بدلونونه چې په انساني ناروغانو کې پیژندل شوي ممکن د کرینیو فاسیل مورفوجینسیس په جریان کې د SPECC1L فعالیت کې کوچني نیمګړتیاوې رامینځته کړي چې د دوی د اوروفیسیل درزونو تشریح کولو لپاره کافي دي.د SPECC1L پر بنسټ د انټر سیلولر تماسونو تنظیم کول ممکن د فیرینجیل آرچونو په پالاتوجینیزس او فیوژن کې هم رول ولوبوي.د SPECC1L فعالیت نور مطالعات به په CNCC کې د موقتي انټر سیلولر اړیکو رول په روښانه کولو کې مرسته وکړي د نیوروپیتیلیل سیل حرکت او کرینیوفیسیل مورفوګینسیس کې د عصبي ټیوب بندیدو پرمهال.
د U2OS اوستیوسارکوما کنټرول او د SPECC1L-kd حجرې دمخه تشریح شوي (سعدي او نور.، 2011).د SPECC1L په وړاندې انټي باډي هم پخوا هم مشخص شوي دي (Saadi et al., 2011).د β-کیټینین ضد انټي باډیز (خرگوش؛ 1:1000؛ سانتا کروز، دالاس، TX) (ماوس؛ 1:1000؛ د سیل سیګنالینګ ټیکنالوژي، ډنورس، MA)، myosin IIb (1:1000؛ Sigma-Aldrich، St. Louis) ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; د سیل سیګنال کولو ټیکنالوژي, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ) , KI67 (1:1000؛ د سیل سیګنال کولو ټیکنالوژي، ډنورس، MA)، cleaved caspase 3 (1:1000؛ د سیل سیګنال کولو ټیکنالوژي، Danvers، MA) او β-actin (1:2500؛ Sigma-Aldrich، St. Louis, MO) لکه څنګه چې تشریح شوي کارول شوي..د Actin filaments د Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado) سره داغ شوي.
د U2OS کنټرول حجرې او د SPECC1L-kd حجرې په معیاري لوړ ګلوکوز DMEM کې د 10٪ جنین بووین سیرم (د ژوند ټیکنالوژۍ، کارلسباد، CA) سره ضمیمه شوي.د AJ بدلونونو لپاره، 2 x 105 حجرې په شیشې کې تخم شوي چې د 0.1٪ پورسین جیلاتین (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) سره درملنه شوي او د حجرو په شکل کې د بدلون لپاره لیدل شوي.حجرې په مختلفو ټاکل شوي وختونو کې راټول شوي: د تخم کرلو څخه 4 ساعته وروسته (t = 1)، د تخم کرلو څخه 24 ساعته وروسته (t = 2)، د حجرو په شکل کې بدلون (t = 3)، د حجرو په شکل کې بدلون (t = 4) 24 ساعته وروسته د حجری شکل بدلون (t = 5) او 48 ساعته وروسته د حجری شکل بدلون (t = 6) (انځور 1, 2, 3).د PI3K-AKT لارې د تعدیل کولو لپاره، حجرې د PI3K-AKT مخنیوی کونکي ورټمینین (TOCRIS بایوسینس، مینیپولیس، مینیسوټا) یا SC-79 فعالونکي (TOCRIS بایوسینس، مینیاپولیس اډمز، مینیسوټا) سره په نښه شوي غلظت کې کلتور شوي.هغه وسیله چې کیمیاوي مواد لري هره ورځ بدلیږي.
د فریم په واسطه ریکارډونه په ژوندی کنټرول او KD حجرو کې د نورمال کلتور شرایطو لاندې رامینځته شوي ، او د مرحله برعکس عکسونه د 7 ورځو لپاره په هر 10 دقیقو کې راټول شوي.عکسونه د کمپیوټر لخوا کنټرول شوي Leica DM IRB الټو مایکروسکوپ په کارولو سره ترلاسه شوي چې په میخانیکي مرحله سمبال شوي او د 10 × N-PLAN هدف د QImaging Retiga-SRV کیمرې سره وصل شوي.د عکس اخیستنې په جریان کې، د حجرو کلتورونه د 5٪ CO2 سره په مرطوب فضا کې په 37 ° C کې ساتل شوي.
دوه جین ټراپ ES سیل لینونه DTM096 او RRH048 د سیمه ایز میوټینټ ماوس سرچینې مرکز (UC Davis, CA) څخه د سپیک 11 نیمګړې موږک لاینونو رامینځته کولو لپاره کارول شوي ، چې ټاکل شوي Specc1lgtDTM096 او Specc1lgtRRH046.په لنډه توګه، 129/REJ ES حجرې په C57BL6 بلاسټوسیسټونو کې داخل شوي.پایله لرونکي chimeric نارینه موږکان د ښځینه C57BL6 موږکانو سره نسل شوي ترڅو د ایګوټي کوټ رنګ سره اولاد وپیژني.د جین ټراپ ویکتور داخلونو شتون د هیټروزایګوټس پیژندلو لپاره کارول شوی و.موږکان د 129/REJ؛C57BL6 په مخلوط پس منظر کې ساتل شوي.د جینیټیک ټریپ ویکتور د داخلولو ځای موقعیت د RT-PCR، جینوم ترتیب، او جینیاتي تکمیل (اضافی شکل 1) لخوا تایید شوی.د ډبل هیتروزیګوس سپیک1lGT موږکانو د CNCC نسب موندلو لپاره، ROSAmTmG (#007576) او Wnt1-Cre (#003829) موږکان (د جیکسن لابراتوار، بار هاربر، ME) څخه تیر شوي ترڅو د ROSAmTmG او Wnt1-Crecry په ټولو امپیلټینټ Speeletant تولید کړي.په موږکانو کې ټولې تجربې د کانساس طبي مرکز پوهنتون د څارویو پاملرنې او کارولو کمیټې لخوا تصویب شوي پروتوکولونو سره سم ترسره شوې.
جنین په (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) د خونې په حرارت کې د 60 دقیقو لپاره ټاکل شوي.د X-gal داغ جوړونې محلول کې د فکس کولو وروسته (5 mm پوټاشیم فیریکیانایډ، 5 mm پوټاشیم فیروکیانایډ، 2 mm MgCl2، 0.01٪ سوډیم deoxycholate، 0.02٪ NP-40، 1 mg/ml X-gal) د داغ پراختیا په 3 ° C کې ترسره شوه. .°C د 1-6 ساعتونو دننه.جنینونه په 4٪ PFA کې وروسته فکس شوي او لیدل شوي.
د غربي بلاټینګ لپاره، حجرې په غیر فعال لیسز بفر (Promega, Fitchburg, WI) کې د HALT پروټیز مخنیوی کونکو مخلوط سره ضمیمه شوي (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates په 12٪ پولیکریلامایډ مینی پروټین TGX چمتو شوي جیلونو (بایو راډ، هرکولس، CA) کې پروسس شوي او د اموبیلون PVDF جھلی (EMD ملیپور، بلریکا، MA) ته لیږدول شوي.غشا په PBS کې په 5% شیدو کې بند شوي چې 0.1% Tween لري.انټي باډي په شپه کې د 4 درجې سانتي ګراد یا د خونې په حرارت کې د یو ساعت لپاره سینګار شوي.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) د سیګنال تولید لپاره کارول شوی و.د معافیت لپاره، جنینونه د شپې په 4٪ PFA/PBS کې ټاکل شوي او کریوپریسور شوي.د نسج کرایوسیکشنونه په PBS کې بند شوي چې 1% نورمال وزې سیروم (Thermo Scientific, Waltham, MA) او 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) لري او بیا په انکیوبټر کې په 4°C کې انکیوب شوي. شپهد انټي باډي او فلوروسینټ ثانوي انټي باډي (1:1000) سره د 1 ساعت لپاره په 4 درجې سانتي ګراد کې.داغ شوي برخې په پرو لونګ طلا میډیم کې ځای په ځای شوي (Thermo Scientific, Waltham MA) او فلیټ عکسونه د Leica TCS SPE کنفوکال مایکروسکوپ په کارولو سره ترلاسه شوي.هر معافیت د دریو خپلواکو تجربو په توګه د لږترلږه دوه متغیر جنینونو سیروسیکشنونو په توګه ترسره شوی.یوه نمایشي تجربه ښودل شوې.
حجرې په تعدیل شوي RIPA بفر (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, او د HALT پروټیز مخنیوی کونکي (Sigma-Aldrich, MOI)) کې ځای پرځای شوي. په لنډه توګه، lysates د پروټین G مقناطیسي موتی (Life Technologies, Carlsbad, CA) سره مخکې پاک شوي او بیا د شپې په 4°C کې د انټي SPECC1L یا IgG پروټین G پروټین موتی سره د SPECC1L استخراج لپاره کارول شوي او د انټي پوټکي په کارولو سره لویدیځ blotting ترسره شوي. -β-کیټینین انټي باډي پورته تشریح شوي د شریک IP تجربې ښودل شوي د څلورو خپلواکو تجربو نمایندګي کوي.
ثابت کلتوري حجرې یا د موږک جنین نسجونه د کنساس پوهنتون طبي مرکز کې د الکترون مایکروسکوپي مرکز ته ورکړل شوي.په لنډه توګه، نمونې په EMbed 812 رال کې ځای پرځای شوي (د الکترون مایکروسکوپي ساینس، فورټ واشنګټن، PA)، د شپې په 60 درجو کې پولیمر شوی، او په 80 nm کې د لییکا UC7 الټرا مایکروټوم په کارولو سره چې د الماس تیغ سره سمبال شوی و.برخې د JEOL JEM-1400 لیږد بریښنایی مایکروسکوپ په کارولو سره لیدل شوي چې د 100 kV لابراتوار ټوپک سره سمبال شوي.
دا مقاله څنګه حواله کول: ولسن، NR او نور.د SPECC1L کمښت د ټوټې شوي بندونو د ثبات د زیاتوالي او د کرینیل عصبي کریسټ حجرو د کمیدو لامل کیږي.ساینس۶، ۱۷۷۳۵ ;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
سینټ جین، جې-پی.د عصبي کریسټ داخلول او توپیر.(د پسرلي ساینس + سوداګریزې رسنۍ؛ لینډز بایوسینس/Eurekah.com، 2006).
Cordero، DR et al.د کرینیل عصبي کریسټ حجرې په حرکت کې: د کرینیو فاسیل پراختیا کې د دوی رول.د طبي جینیتیک امریکایی ژورنال.برخه A 155A، 270-279، doi: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
بولنډ، RP نیوروکریسټوپاتیا: د 20 کلونو په اوږدو کې د هغې وده او پراختیا.د ماشومانو درملنه.رنځپوهنهلابراتواردارو.17، 1-25 (1997).
منګولډ ای.، لودویګ KU او Noten MM د orofacial clefts په جینیات کې بریا.په مالیکولر درمل کې رجحانات 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. and Riley, FM د کرینیل عصبي کریسټ حجرو مهاجرت او د کرینیوفیسیل پراختیا په جریان کې نمونې کولو مالیکول میکانیزم.پراختیا 137، 2605-2621، doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
ډیکسن، MJ، مارازیتا، ML، بیټی، TH او موری، JK کلیفټ شونډه او تالو: د جینیاتي او چاپیریال اغیزو پوهه.طبیعي تبصرهجینیات 12، 167-178، doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
انگرام، CR et al.د انټرفیرون تنظیم کونکي فاکتور -6 (Irf6) - د کموالي موږکونو کې د پوټکي ، غړو او کرینیو فاسیل سیمې غیر معمولي مورفوګینسیس.ملي جینټ.38، 1335-1340، doi: 10.1038/ng1903 (2006).
پییرارډ جانوید، ایم او نور.په GRHL3 کې غالب بدلونونه د وین ډر واورډ سنډروم لامل کیږي او د خولې پیریډرم وده زیانمنوي.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
هاریس، MJ او Juriloff، DM د عصبي ټیوب بندیدو کې نیمګړتیاو سره د موږک بدلونونو لیست تازه کړئ او د عصبي ټیوب بندیدو بشپړ جنیټیک پوهاوي په لور پرمختګ وکړئ.د زیږون د نیمګړتیاوو څیړنه.برخه A، کلینیکي او مالیکولر ټریټولوژي 88، 653-669، doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K- منځګړیتوب PDGFRalpha سیګنالینګ د p53 پورې تړلي انټرا سیلولر لارې له لارې د کنکال پراختیا کې بقا او خپریدل تنظیموي.د جین پراختیا 28، 1005-1017، doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
کوپ، AJ، شنه، ND او Murdoch، JN ګډوډ: د عصبي ټیوب تړلو سره د متقابل توسیع اړیکه.په نیورولوژي کې رجحانات.26، 453–455، doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).