347 سټینلیس سټیل کویل شوي ټیوب کیمیاوي اجزا ، د ناول انټرفیرون - ځواب ویونکي انساني لیوکوسایټ انټيجن-A (HLA-A) چپرون پروټینونو پیژندنه د کراس تړل شوي ډله ایز سپیکرومیټري (CLMS) په کارولو سره

د Nature.com لیدلو لپاره مننه.تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).برسېره پردې، د روان ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کوو.
سلایډونه په هر سلایډ کې درې مقالې ښیې.د هر سلایډ له لارې حرکت کولو لپاره شاته او بل بټن وکاروئ، یا د سلایډ کنټرولر بټن په پای کې د هر سلایډ له لارې حرکت وکړئ.

د تولید ځانګړتیاوې

د سټینلیس سټیل 347L کویل ټیوبونه ، د فولادو درجه: SS347L

د انټرفیرون سیګنلینګ سیسټم د چاپیریال څخه د ډیری رنځجنیک او داخلي رنځولوژیکي سیګنالونو پراخه لړۍ ته قوي سایټوکین غبرګون هڅوي ، چې په پایله کې د انٹرفیرون - انډکیبل پروټینونو فرعي سیټونو شاملول.موږ د DSS منځګړیتوب کراس-لینک ماس سپیکرومیټري (CLMS) پلي کړ ترڅو د انټرفیرون هڅول شوي پروټینونو ډومین کې د پروټین - پروټین نوي تعاملات کشف کړي.د متوقع انٹرفیرون - انډکیبل پروټینونو سربیره ، موږ د کینونیکي انټرفیرون - انډکیبل پروټینونو لکه MX1 ، USP18 ، OAS3 ، او STAT1 ناول انټرمولیکولر او انټرمولیکولر کراس پورې تړلي اضافه کونکي هم پیژندلي.موږ د HLA-A پروټینونو (H2BFS-HLA-A-HMGA1) لخوا د شریک معافیت په کارولو سره رامینځته شوي د انټرفیرون - انډکیبل پروټین شبکې ناول سیټ آرتوګونل اعتبار باندې تمرکز وکړ او د مالیکول ډینامیک ماډلینګ په کارولو سره د دوی نورې مطالعې.د پروټین کمپلیکس د جوړښتي متحرکاتو ماډل کول د متقابل عمل ډیری سایټونه په ګوته کړل چې د CLMS موندنو کې پیژندل شوي تعامل منعکس کوي.په ګډه، موږ د CLMS یوه ازمایښتي مطالعه وړاندې کوو ترڅو د انټرفیرون لخوا هڅول شوي نوي سیګنلینګ کمپلیکسونه وپیژنو، او د تومور مایکرو چاپیریال کې د پروټین تعاملاتو نوي متحرکاتو پیژندلو لپاره د CLMS پراخه کارونې ته سترګې په لار یو.
مخکې له دې چې د انتفاعي معافیت غبرګون پیل شي، د کوربه طبیعي دفاعي سیسټم یو انټي مایکروبیل غبرګون رامینځته کوي چې د پټو الفا هیلیکل سایټوکینونو د کورنۍ لخوا منځګړیتوب کیږي چې د انټرفیرون (IFNs) په نوم یادیږي.د I IFN ټولګي IFNα او IFNβ د سیلولر غبرګونونه فعالوي، په شمول د انټي ویرل، پروپوپټوټیک، پروینفلامیټري، او ضد ضد حالتونه.په انسانانو کې، د IFNα 13 فرعي ډولونه پیژندل شوي، ټول په کروموزوم 91 کې کلستر شوي. په حیرانتیا سره، یوازې IFNα2 د کلینیکي کارونې لپاره مطالعه شوي.په دې وروستیو کې، د IFNα نورو فرعي ډولونو څیړنې ته ځانګړې پاملرنه شوې.یوې وروستۍ څیړنې ښودلې چې IFNα14 د کانونیکي IFNα2 فرعي ډول په پرتله د HBV2 او HIV-13,4 نقل په محدودولو کې یو له خورا مؤثره isoforms څخه دی.
دا تاسیس شوی چې فعال شوي ډول I انٹرفیرون ریسیپټر کمپلیکسونه (IFNAR1 او IFNAR2) د جنوس کنیسس TYK2 او JAK15,6 لخوا منځګړیتوب د سیګنال لیږد کاسکیډ رامینځته کوي.دا جانوس کنیز د فاسفوریلایټ سیګنال لیږدونکي او لیږدونکي پروټین فعالونکي (STAT1 او STAT2) د تایروسین په پاتې شونو کې رامینځته کوي ترڅو د SH2 ډومین منځګړیتوب هیټروډیمرائزیشن پیل کړي.وروسته، IRF9 د STAT heterodimers سره تړلي ترڅو د IFN-محرک فکتور 3 جین (ISGF3) تریمریک کمپلیکس جوړ کړي، کوم چې نیوکلیوس ته لیږدوي او د 2000 څخه ډیر د انټرفیرون محرک جینونو (ISGs) 5,87,6.
ISGs د طبیعي معافیت سیسټم ملا جوړوي، په ځانګړې توګه د ویروس برید په ځواب کې.د ویروس انتان په وړاندې د دفاع د لومړۍ کرښې په توګه، حجرې په چټکۍ سره د بیولوژیکي فعالیتونو پراخه لړۍ سره د سیلولر پروټینونو پراخه تعامل ځای پرځای کوي.پدې پروټینونو کې د نمونې پیژندنې ریسیپټرې ، د سیګنال مالیکولونه ، د لیږد فکتورونه ، او پروټینونه د مستقیم انټي ویرل افعال سره ، او همدارنګه د معافیت غبرګون منفي تنظیم کونکي شامل دي 9.د ISG فعالیت په اړه ډیری معلومات د فعال سکرینونو څخه راځي چې د overexpression سکرینونو 10,11 یا د جین خاموش کولو تخنیکونو (siRNA, RNAi او CRISPR) 12,13 په کارولو سره په کوم کې چې انفرادي ISGs څرګند یا منع شوي او د دوی فعالیت په مختلف ویروسونو ازمول کیږي.که څه هم دې مطالعاتو د انفرادي ISGs انټي ویرل ملکیتونه مشخص کړي ، د هر ISG اصلي مالیکول میکانیزمونه په پراخه کچه نامعلوم پاتې دي.دا عموما منل کیږي چې ډیری پروټینونه د بشپړ فعالیت ډاډ ترلاسه کولو لپاره د یو یا ډیرو سایټوکینونو سره تعامل کوي، نو یا ISGs مستقیم تعامل کوي یا د دوی تعامل د سیلولر پروټینونو لخوا منځګړیتوب کیږي.د مثال په توګه، د فوټوکراس لینک شوي پروټومکس وروستۍ مطالعې د ATPase VCP/p97 د IFITM3 متقابل عمل لوی شریک په توګه پیژندلی، چې مخنیوی یې د ویروس ذرو 14 سره د IFITM3 د لیسوسومال ترتیب، بدلون، او کوټرانسپورټ کې نیمګړتیاو لامل کیږي.د معافیت په کارولو سره، موږ د VAPA، یو ویسیکل پورې تړلی پروټین د IFITM1/2/3 سره د متقابل ملګري په توګه پیژندلی چې د کولیسټرول منځګړیتوب ویروس منځګړیتوب کوي، او دا د یو بل مطالعې لخوا د خمیر دوه هایبرډ سیسټم په کارولو سره تایید شوی.ساینسي ملاتړ 15 , 16 .
یو بنسټیز بیولوژیکي پروسه چې د انفیکشن او وژونکي بدلون په فشار کې دخیل وي د انټيجن پریزنټیشن دی، کوم چې د لوی هسټوکمپاتبلیت پیچلي (MHC) مالیکولونو لخوا منځګړیتوب کیږي.پیپټایډونه (د 8-12 امینو اسیدونو اوږد) د پاک شوي، وخت څخه مخکې ختم شوي یا غلط فولډ شوي پروټینونه په MHC-I heterodimer کې بار شوي (د MHC-I درنو او سپکو زنځیرونو څخه جوړ شوي چې د β-2-microglobulin په نوم یادېږي؛ β2M) 17,18.په پایله کې ثابت شوي MHC-I ټریمرونه د حجرو سطحې ته لیږدول کیږي، چیرته چې دوی د CD8 + T حجرو (cytotoxic T حجرو) 17 ته انټرا سیلولر پیپټایډونه وړاندې کوي.T حجرې دا رنځجن او حجرې پیژني او له مینځه وړي چې د تومور ځانګړي انټيجن لري.په پایله کې، رنځجن او تومور حجرې اکثرا د انټيجن پریزنټشن پروسه فشاروي ترڅو د معافیت نظارت مخه ونیسي.برسېره پردې، MHC-I په 40-90٪ کې د انسان تومورونو کې کم شوی او ډیری وختونه د ضعیف تشخیص سره تړاو لري.
هغه جینونه چې د ناروغیو په وړاندې غبرګون کې ښکیل دي باید ژر تر ژره د آرامۍ حالت او د فعال لیږد حالت ترمنځ بدل شي.له همدې امله، ډیری سیلولر پروټینونه داسې انګیرل کیږي چې د لنډ وخت په اوږدو کې د لوړ IFN غوښتنې په ځواب کې دخیل وي، په شمول د پروموټر کروماتین 20,21 بیا جوړونه او ترمیم.ډیری مطالعې د IFN په شتون کې د انفرادي ISG پروټین شریکانو پیژندلو باندې تمرکز کړی.د ماډل حجرو سیسټمونو کې ډیری پروټومیک او ټرانسکریټومیک مطالعاتو د سیلولر منظرې په اړه د IFN اغیز روښانه کړی.په هرصورت، د انټرفیرون لخوا هڅول شوي متحرکاتو په اړه د مخ په زیاتیدونکي پوهاوي سره سره، موږ لاهم د ISGs د ښکیلتیا په اړه لږ پوهیږو.کله چې د انټرفیرون سیګنلینګ پیچلتیا او وخت پورې تړلي متحرکاتو په پام کې نیولو سره ، دوه پوښتنې راپورته کیږي: (i) ایا دا ممکنه ده چې په ګړندۍ سیګنلینګ کې د ملټي پروټین کمپلیکسونو ثبات او ځړول ، او (ii) ایا دا تعاملات په 3D ځای کې نقشه کیدی شي؟
د دې مسلو د حل لپاره، موږ د IFNα-حوصلې شوي پروټین تعامل شبکې او د هغې متحرکاتو مطالعه کولو لپاره د ډله ایز سپیکرومیټري (CLMS) سره یوځای د ډیسکینیمایډ فرعي منځګړیتوب کیمیاوي کراس لینکینګ (DSS) پلي کړ.DSS په vivo کې د پروټینونو او/یا پروټین کمپلیکسونو نږدې پاتې شونو تر مینځ کوولینټ بانډونه اضافه کوي.د MS وروسته تحلیل ځانګړي کراس لینکینګ سایټونه په ګوته کوي چې د یو ځانګړي پروټین دننه د ساحو ځایي نږدېوالی منعکس کوي ، چې د داخلي اړیکې په نوم یادیږي ، یا د پروټین کمپلیکسونو کې فرعي واحدونه چې د متقابل اړیکو په نوم یادیږي.د دې طریقې په کارولو سره، موږ د پروټین - پروټین ډیری نوي کمپلیکسونه او همدارنګه د انټرفیرون هڅول ملټي پروټین تعامل شبکې پیژندلي دي.د دې نوي تعاملاتو د یوې فرعي سیټ ازموینې په واسطه، موږ دا په ډاګه کوو چې H2BFS (H2B هسټون ډول FS؛ بیا وروسته د H2B په نوم یادیږي) او MDN1 د HLA-A لپاره د پابند شریکانو په توګه عمل کوي.
Flo-1 حجرې د esophageal adenocarcinoma په ویټرو ماډلونو کې یو له غوره پیژندل شوي څخه دي ځکه چې دوی د esophageal تومورونو 22,23 کلیدي ځانګړتیاو ته اشاره کوي.په هرصورت، ټول تومورونه معافیت نلري، او د دې لپاره چې معلومه کړي چې آیا Flo-1 حجرې د انټرفیرون درملنې ته ځواب ورکوي، موږ د Flo-1 حجرې د 10 ng/ml IFNα سره د 72 ساعتونو لپاره درملنه وکړه.د Flo-1 حجرو د pSTAT1 او IRF1 لومړني شاملول ښودلي، چې د درملنې څخه 2 ساعته وروسته پیل کیږي او د 72 ساعتونو لپاره دوام لري، د IRF1 په سټیشنري کچه کې د وخت پورې تړلي کمښت سره (شکل 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, and ISG15) وموندل شول چې د 6 ساعتونو وروسته په کلکه هڅول شوي، د IFNα (شکل 1A) ته د کلاسیک منځني او وروستي مرحلې ځوابونو نقل کول.په ګډه، دا ډاټا وړاندیز کوي چې دا سیلولر ماډل د انټرفیرون غبرګونونو مطالعې لپاره کارول کیدی شي.
د IFNα درملنې وروسته په Flo-1 حجرو کې د پروټین توپیر غبرګون.(A) په Flo-1 حجرو کې د پروټین څرګندونه د 10 ng/ml IFNα سره د 2, 6, 24, 48 او 72 ساعتونو لپاره درملنه شوې د ISG انټي باډونو په کارولو سره د امونبلوټ لخوا تحلیل شوي.(B) Coomassie نیلي داغ شوي SDS-PAGE جیل د ټول حجرو استخراج د DSS سره د کراس لینک کولو وروسته د ټاکل شوي وخت او غلظت لپاره.(C) نمایندګي امیونو بلاټ د ورته نمونو څخه د p53(DO-1) انټي باډي سره معاینه شوي ترڅو د پروټین کراس لینک کولو درجې ارزونه وکړي.
د پروټین متقابل عمل موقعیت کې د لیدو لپاره ، موږ DSS کارولی ، چې په پراخه کچه کارول کیږي د کراس لینک کولو اجنټ د دې د لوړ جھلی پارمیتا او نسبتا لنډ عکس العمل وخت له امله.د عکس العمل لنډ وخت د کراس لینک شوي پروټینونو لوی مجموعو رامینځته کیدو مخنیوي کې مرسته کوي ، پدې توګه د کراس لینکر ثبات ساتي.د دې لپاره چې د DSS مطلوب غلظت وټاکو او د ډیر کراس لینک کولو مخه ونیسو، موږ لومړی د 5، 2.5، او 1 mM DSS ته په ترتیب سره د 5، 10، 5، او 30 دقیقو لپاره حجرې ښکاره کړې، او د Coomassie-stained SDS-PAGE په واسطه یې lysates تحلیل کړل. (ډاټا نه ښودل شوې).د حجرو lysates داسې ښکاري چې په خورا ټیټ غلظت او په لنډ وخت کې په لوړه کچه سره نښلول شوي.له همدې امله، DSS په 5 دقیقو کې 1، 0.5، او 0.1 mM ته ټایټ شوی (شکل 1B).د 0.5 mM DSS سره د 5 دقیقو لپاره غوره کراس لینک لیدل شوی، او دا شرایط د IFNα سره درملنه شوي حجرو لپاره غوره شوي.برسېره پردې، شکل 1C یو لویدیځ داغ ښیې چې د p53 (DO-1) انټي باډي په کارولو سره ترسره شوی ترڅو د پروټین کراس لینک کولو درجې ارزونه وکړي.
د Flo-1 حجرې د 10 ng/ml IFNα سره د 24 ساعتونو لپاره د کراس لینکر اضافه کولو دمخه درملنه شوې.سره تړلي حجرې وروسته د دوه مرحلې پروټولوسیس لخوا لیز شوي او پروټینونه د FASP لخوا پروسس شوي (2) 24,25.سره تړلي ټریپټیک پیپټایډونه د ډله ایز سپیکرومیټري لخوا تحلیل شوي (انځور 2).MS/MS سپیکٹرا بیا د پروټین ترتیب سره سمون لري او د MaxQuant26,27 سره اندازه کیږي.کراس تړل شوي پیپټایډونه د ترلاسه شوي سپیکٹرا څخه د SIM-XL برنامې په کارولو سره پیژندل شوي ، او انفرادي مرکبات د xQuest28 او SIM-XL29 خلاصې سرچینې کمپیوټري سافټویر پایپ لاینونو په کارولو سره په پیچلي شبکه کې یوځای شوي (انځور 2).SIM-XL د پروټین - پروټین تعاملات، داخلي زنځیرونه او انفرادي زنځیرونه په ساده یا پیچلي پروټین مرکبونو کې پیژني او د پروټین جوړښتونو کې د تعاملاتو لیدلو لپاره سکریپټونه چمتو کوي.برسېره پردې، دا د MS/MS29 سپیکٹرم کیفیت سره سم د هر کراس حواله د ID سکور په توګه درجه بندي کوي.د پروټین - پروټین یو شمیر خورا معتبر تعاملات او پیچلتیاوې پیژندل شوي، او د تعاملاتو نوې ټولګه د مالیکولر ډینامیک (MD) ماډلینګ (انځور 2) 30، 31 په کارولو سره د ګډ معافیت او د کمپلیکسونو جوړښتي بدلونونو په کارولو سره نور تحقیق شوی.
د CLMS میتود سکیمیک عمومي کتنه.د Flo-1 حجرې د 10 ng/ml IFNα سره د 24 ساعتونو لپاره درملنه شوې وه چې وروسته د DSS په کارولو سره د پروټین کراس لینک کولو وروسته د حجرو لیسس او ټریپسینائزیشن.سره تړلي نمونې د اوربټراپ ماس سپیکٹرومیټر په کارولو سره تحلیل شوي او د LC-MS/MS په جریان کې د پیپټایډ مخکیني ټوټې کولو لپاره نور نمونه شوي.دوه تړل شوي پیپټایډونه د ترلاسه شوي سپیکٹرا څخه د Crosslinked Peptides (SIM-XL) برنامې د سپیکٹرم پیژندنې ماشین په کارولو سره پیژندل شوي ، او ټول مرکبات د کمپیوټري پایپ لاینونو په کارولو سره په پیچلي شبکه کې یوځای شوي.د غلط مثبت نرخ (FDR) نمرو پراساس د ټیټ باور متقابل عمل فلټر کړئ.د پروټین - پروټین یو شمیر نوي تعاملات د شریک معافیت په کارولو سره تایید شوي، او په کمپلیکسونو کې بدلونونه د مالیکولر ډینامیک (MD) ماډلینګ په کارولو سره معاینه شوي.
ټولټال ~30,500 او ~ 28,500 پیپټایډونه په ترتیب سره په غیر محرک او محرک IFNα نمونو کې د MaxQuant په کارولو سره کشف شوي (اضافی جدول S1، انځور 3A).په دواړو قضیو کې د پیپټایډ اوږدوالی ویش د لوی پیپټایډونو لوړ تناسب ښودلی، چې د کراس سره تړلي پیپټایډونو شتون په ګوته کوي (انځور 3B,C).برسېره پردې، د لوی پیپټایډونو لوی تناسب د IFNα درملنې نمونو کې د 40-55 رینج کې شتون درلود (انځور 3C).د log2 شدت په وړاندې د پروټین نقشه وښودله چې کلاسیک انټرفیرون محرک پروټینونه د نه درملنې نمونو په پرتله خورا بډایه وو، په شمول د MX1، IFIT1/3، OAS2/3، DDX58، او HLA-F (شکل 3D).د IFNα درملنې په ځواب کې د درې چنده څخه ډیر د پروټینونو لپاره د لارو تحلیل د Reactome pathway ډیټابیس په کارولو سره بډایه شوي وښودله چې د MHC-I- منځګړیتوب انټيجن پریزنټشن او پروسس ترټولو غالب لاره وه (شکل 3E).د پخوانیو راپورونو سره سم، د انټي ویروس غبرګونونه چې د OAS او ISG15 لخوا منځګړیتوب شوي او همدارنګه IFNα/β او د سایټوکین سیګنالینګ د فعالو لارو څخه وو.برسېره پردې، د لیسین او سیرین ځانګړي پروټین کراس لینکونه د اصلي ترلاسه شوي MS/MS سپیکٹرا څخه د SIM-XL په کارولو سره پیژندل شوي.یوې وروستۍ مطالعې راپور ورکړی چې 104 ISGs د 9 ویروس ټولګیو څخه 20 ویروسونه په 5 حجرو ډولونو کې د انفرادي ISG overexpression مطالعاتو میټا تحلیل په واسطه خپروي.په هرصورت، د لوی ډیټاسیټونو د سکرین کولو لپاره د کمپیوټري محدودیتونو د لرې کولو لپاره، موږ د کوچني ډیټاسیټ سره پیل وکړ ترڅو د IRDS جینونو لیست تر مینځ احتمالي تعاملات وپلټئ چې د Padaria et al. لخوا راپور شوي، چې ډیری یې ISGs دي.
د IFNα (د MaxQuant څخه ترلاسه شوي ډاټا) په ځواب کې د توپیر لرونکي کراس تړل شوي پروټینونو پیژندنه.(A) د وین ډیاګرام د عام او ځانګړي پیپټایډونو شمیر نمایندګي کوي چې په IFNα14 درملنه شوي او نه درملنه شوي Flo-1 نمونو کې پیژندل شوي.د پیپټایډ اوږدوالی د نه درملنې (B) او IFNα درملنې (C) crosslinked نمونو ویش.(D) د تودوخې نقشه چې د log2 (LFQ شدت) استازیتوب کوي د غیر درملنې او IFNα14 درملنه شوي Flo-1 حجرو ترمنځ.کیڼ تخته هغه پروټینونه ښیې چې د IFNα په شتون کې خورا فعاله شوي.(E) هسټوګرام د IFNα درملنې وروسته د غني کولو 20 لوی لارې استازیتوب کوي.د Reactome لارې ډیټابیس د IFNα ځواب ویونکي پروټینونو کې له څلور چنده ډیر بدلونونه تحلیل کړل.
د انټرفیرون منځګړیتوب ISG محرک په ښه توګه مستند شوی، مګر په مالیکولر کچه دا په ښه توګه نه پوهیږي چې دا پروټینونه څنګه د بیولوژیکي فعالیتونو په پراخه لړۍ کې پای ته رسیږي.موږ د پیژندل شوي ISGs ترمنځ د لوړې کچې اعتماد سره د پروټین تعاملات تحقیق کړل.په زړه پورې، موږ یوه شبکه په ګوته کړه چې په شمول د MX1، USP18، ROBO1، OAS3، او STAT1 پروټینونه چې د IFNα درملنې په ځواب کې یو لوی پیچلي جوړوي (شکل 4، جدول S2) 32,33,34.تر ټولو مهم، دا تعاملات په ټولو درې اړخیزو کې موندل شوي چې د IFNα سره درملنه شوي او د درملنې په نمونو کې ندي موندل شوي، وړاندیز کوي چې دوی په ځانګړې توګه د IFNα درملنې په ځواب کې رامینځته شوي.دا معلومه ده چې STAT1 په لیږد سره د دې ISGs څرګندونې تنظیموي، مګر د پروټین په کچه د ISGs سره د هغې تعامل نه دی مطالعه شوی.د STAT1 کرسټال جوړښت وښودله چې د دې هیلیکل ډومین (CCD) د ډیمرز 35 جوړیدو پرمهال د DNA یا پروټومر سره په تعامل کې ښکیل ندي.دا α-helices د helical helix جوړښت جوړوي کوم چې د متقابل عمل لپاره په عمده توګه د هایدروفیلیک سطح ساحه چمتو کوي 35.زموږ د CLMS معلوماتو کې، موږ ولیدل چې د STAT1 سره ډیری تعاملات د SH2 ډومین کې د CCD څخه مخکې، د لینکر ډومین، یا د C-ټرمینل پای (پاشیش 700-708) (شکل 4A) کې پیښ شوي.یوې پخوانۍ څیړنې راپور ورکړی چې USP18 د STAT2 CCD او DNA-binding ډومین (DBD) پورې تړلی دی او د I interferon ریسیپټر IFNAR2 ډول فرعي واحد ته ګمارل شوی ترڅو د I interferon سیګنال 24 ډول مخنیوی منځګړیتوب وکړي.زموږ معلوماتو دا هم ښودلې چې د USP18 کتلټیک ډومین د STAT1 DBD (شکل 4A,D) سره اړیکه لري، وړاندیز کوي چې دواړه STAT1 او STAT2 ممکن د USP18 IFNAR2 ته راجلبولو کې رول ولوبوي.
د پروټین-پروټین ISG شبکه د کراس تړل شوي حجرو کې پیژندل شوي چې د IFNα سره درملنه کیږي.(A) د 2D متقابل عمل پلاټ د پروټین - پروټین تعاملات ښیې (د SIM-XL برنامه کې رامینځته شوي) ، د لینونو سره چې د متقابل تعامل استازیتوب کوي (د کراس لینک کټ آف 3.5 ته ټاکل شوی).د مختلف پیژندنې ډومینونه د دوی د رنګ 32 لخوا په نښه شوي: MX1 ډومین، Dynamin_N (73-249)، Dynamin_M (259-547)، او GED (569-660).OAS3 ډومینونه: OAS1_C (160-344)، OAS1_C (559-745)، NTP_transf_2 (780-872)، او OAS1_C (903-108).ډومین ROBO1، Ig_3 (67-151)، I-set (170–258)، I-set (262–347)، Ig_3 (350–432)، Ig_3 (454–529)، fn3 (562–646)، fn3 (678–758) او fn3 (777–864).د STAT1 ساحې: STAT_int (2–120)، STAT_alpha (143–309)، STAT_bind (321–458)، SH2 (573–657)، او STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) د کراس تړل شوي پروټینونو سرکلر لیدونکي (MX1، UBP18، OAS3، ROBO1، او STAT1) په ترتیب سره په نیلي او سور کې لیبل شوي تعاملات او تعاملات.د کراس لینک حد په 3.5 کې ټاکل شوی.ډاټ پلاټونه د MX1 (C)، USP18 (D)، ROBO1 (E)، او OAS3 (F) سره د STAT1 تعامل ځایونه په ګوته کوي، او همدارنګه د دوو پیپټایډونو ترمنځ د K یا S تعامل ځایونه.په انځور کې، د کراس لینک سکور حد 3.0 ته ټاکل شوی.(G) د STAT1 او OAS3 DI ډومینونو ترمنځ د متقابل عمل مختلف سایټونه په PyMol کې د دوی د پروټین جوړښتونو باندې سپر شوي (PyMOL مالیکولر ګرافیک سیسټم، نسخه 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) او OAS3 (pdb id: 4s3n34).) پروګرام.
د USP18 دوه isoforms په انسانانو کې بیان شوي، یو بشپړ اوږدوالی پروټین چې په عمده توګه په نیوکلیوس کې موقعیت لري، او یو isoform پرته له N-ټرمینل ډومین، USP18-sf، چې په مساوي ډول په سایټوپلازم او نیوکلیوس 36 کې ویشل شوی.برسېره پردې، د N-terminus اټکل شوی و چې غیر جوړ شوی وي او د isopeptidase فعالیت یا ISG1537 پابند ته اړتیا نلري.زموږ په څیړنه کې پیژندل شوي ډیری تعاملات د پروټین په N-ټرمینس کې موقعیت لري، وړاندیز کوي چې دا تعاملات د بشپړ اوږدوالی USP18 (شکل 4A،D) کې شامل دي او پدې توګه احتمال لري په نیوکلیو کې واقع شي.سربیره پردې، زموږ معلومات دا هم په ګوته کوي چې N-terminus د پروټین څخه تر پروټین تعامل لپاره ځانګړی دی.د IFNAR2 د پابند کولو سایټ د پاتې شونو 312-368 په منځ کې موقعیت لري، او د پام وړ، په پیچلي کې هیڅ یو پروټین د دې سیمې سره تړلی نه دی (4A) 37,38.دا ډاټا په ګډه اخیستل شوي په ګوته کوي چې د IFNAR2 پابند ډومین په ځانګړي ډول د ریسیپټر پروټین لخوا کارول کیږي.برسېره پردې، یوازې OAS3 او ROBO1 وموندل شول چې د N-terminus او IFNAR2 پابند سایټ (انځور 4A) د ډومینونو سره تړاو لري.
ROBO1 د ټرانس میمبرین سیګنالینګ مالیکولونو د امیونوګلوبولین (Ig) عالي کورنۍ پورې اړه لري او د حجرو په بهر کې پنځه Ig ډومینونه او درې فایبرونیکټین (Fn) ډومینونه لري.دا بهر حجروي ډومینونه د جھلی - نږدې سیمه او یو واحد ټرانس میمبرین هیلکس 39 لخوا تعقیب کیږي. یو غیر منظم انټرا سیلولر سیمه په C-ټرمینس کې موقعیت لري او د محافظت شوي ترتیب شکلونه لري چې د تاثیر کونکي پروټین پابندۍ منځګړیتوب کوي.هغه سیمه چې د امینو اسیدونو څخه ~ 1100 څخه تر 1600 پورې غزیدلی اکثرا ګډوډ وي.موږ وموندله چې MX1 د ROBO1 سره د Ig، Fn، او د انټرا سیلولر ډومینونو له لارې تعامل کوي، پداسې حال کې چې د STAT1 سره ډیری تعاملات د CCD، لینکر ډومین، او د ROBO1 C-ټرمینس (انځور 4A,E) ترمنځ واقع کیږي.له بلې خوا، د DI، DIII، او OAS3 لینکر سیمو سره تعامل په ټول ROBO1 پروټین (انځور 4A) کې ویشل شوي.
د oligoadenylate synthase (OAS) پروټین کورنۍ د انټرا سیلولر ډبل سټرینډډ RNA (dsRNA) مني او وتړي، د جوړښتي بدلونونو څخه تیریږي، او 2′,5′ پورې تړلي oligoadenylates (2-5 As) 40 ترکیبوي.دا وموندل شوه چې د دریو OASs په مینځ کې، OAS3 د dsRNA لپاره ترټولو لوړ تړاو څرګندوي او لږترلږه د 2-5 As ترکیب کوي، کوم چې کولی شي RNase L فعال کړي او په دې توګه د ویروس نقل 41 محدود کړي.د OAS کورنۍ د پولیمیرز بیټا (pol-β) په څیر د نیوکلیوټایډ ټرانسفراز ډومینونو څخه جوړه ده.پخوانیو څیړنو ښودلې چې د C-ټرمینل ډومین (DIII) کتلیتیک فعالیت د dsRNA- پابند ډومین (DI) پورې اړه لري، کوم چې د OAS342 فعالولو لپاره اړین دی.موږ ولیدل چې د OAS3 DI او DII ډومینونه د CCD او د SH2 او STAT1 TAD (شکل 4A,F) تر مینځ د کوچني جنکشن سیمې سره اړیکه لري.د پروټین په جوړښت کې د مختلف کراس لینک کولو سایټونو پوښل د β-شیټ او DBD STAT1 لوپ او یو خلاص جیب یا غار تر مینځ متقابل عمل څرګند کړ چې د OAS3 DI ډومین کې د 60-75 پاتې شونو لخوا رامینځته شوی (انځور 4G).په کمپلیکس کې د پروټینونو سمت دا هم په ګوته کوي چې د OAS3 سره هیڅ یو تعامل د دې DI ډومین (انځور S1A) د DNA پابند کولو وړتیا سره مداخله نه کوي.برسېره پردې، د GTPase MX1 N-ټرمینل ډومین د OAS3 (انځور 4A) د DI او DIII ډومینونو سره په پراخه کچه تعامل کوي.موږ د OAS1 او MX1 ترمنځ تعامل په ټولو دریو IFNα- درملنې تکرارونو کې هم ولید، چیرې چې یو واحد OAS1 ډومین (هم په کټالیټیک ډول فعال) د ټولو دریو MX1 ډومینونو (شکل S2A، B) سره متقابل عمل وکړ.
MX پروټینونه د ډینین په څیر د GTPases د یوې لویې کورنۍ برخه ده چې د N-ټرمینل GTPase ډومین لري چې د GTP سره تړلي او هایدروولیز کوي، یو منځنی ډومین چې په ځان کې منځګړیتوب کوي، او د C-ټرمینل لیوسین زپ چې د GTPase (LZ) په توګه کار کوي. ).ډومین اغیزمن ډومین 25,43.MX1 د ویروس پولیمیریز فرعي واحدونو سره تړلی ترڅو د ویروس جین43 لیږد بند کړي.مخکې راپور شوي خمیر دوه هایبرډ سکرین وښودله چې د PIAS1 سره تړلي MX1 د DNA- پابند فعالیت بندولو سره د STAT1 منځګړیتوب جین فعالولو مخه نیسي او د SUMO E344,45 ligase فعالیت هم لري.دلته، موږ په ډاګه کوو چې MX1 د STAT1 (شکل 4C،D) سره تړاو لري، په هرصورت، دا تعامل څنګه د IFNα په ځواب کې د STAT1 منځګړیتوب جین فعالولو اغیزه کوي نورې مطالعې ته اړتیا لري.برسېره پردې، موږ دا هم وموندله چې MX1 د IFIT3 او DDX60 سره په ټولو دریو IFNα-علاج شوي تکرارونو (انځور S2C) کې اړیکه درلوده.
DDX60 یو IFN- هڅول شوی سایټوپلاسمیک هیلیکیس دی چې دمخه راپور شوي چې د RIG-I-د ویروس RNA46 خپلواک تخریب کې رول لوبوي.دا د RIG-I سره تعامل کوي او خپل سیګنال په ligand-ځانګړي ډول فعالوي 46. DDX60 د DEXD/H-Box هیلیکیس ډومین او د C-ټرمینل هیلیکیس ډومین لري چې ویروس RNA او DNA47 سره تړلي دي.د MX1 او IFIT3 سره د دې ډیری تعاملات د اوږدې N- او C-ټرمینل سیمو کې پرته له کانونیکي ډومینونو یا شکلونو (انځور S2E,F) کې پیښیږي.په هرصورت، MX1 د DEXD/H-Box هیلیکیس ډومین (انځور S2E) سره هم تړاو لري.د IFIT کورنۍ پروټینونه د یو ځانګړي هیلکس-ټرن-هیلکس موټیف ټنډیم کاپي لري چې د ټیتراپیپټایډ تکرار (TPR) په نوم یادیږي.IFIT3 د RIG-I سیګنلینګ مثبت ماډلر و او له همدې امله د MAVS کمپلیکس یوه برخه وموندل شوه.یوځای اخیستل شوي، زموږ ډاټا وړاندیز کوي چې IFIT3 او DDX60 په ابتدايي توګه د IFIT3 د TPR 3-6 ترمنځ سیمه کې اړیکه لري او کیدای شي د RIG-I/MAVS سیګنال (انځور S2F) کې رول ولوبوي.
د دې په پام کې نیولو سره چې د ټول پروټوم سکرین کول په کمپیوټري توګه خورا سخت دي، موږ بیا د IFNα درملنې شوي تکرارونو څخه د شتون لپاره د انسان ټول یونیپروټ ډیټابیس سکرین کړ.په دې نقل کې، موږ د HLA-A لپاره ډیری معتبر متقابلې شبکې وموندلې.د پروټین لارو تحلیل چې د MS/MS سپیکٹرا لخوا پیژندل شوي وښودله چې د MHC-I پر بنسټ د انټيجن پروسس کول او پریزنټشن د انټرفیرون (3D انځور) لخوا هڅول اصلي لاره ده.له همدې امله، موږ د MHC-I مالیکولونو د پروټین تعاملاتو مطالعې باندې تمرکز وکړ چې په ټولو کراس تړل شوي نمونو کې د لوړې درجې باور سره.HLA د α1، α2 او α3 ډومینونو او رڼا زنځیرونو څخه جوړ دی، او مایکروګلوبولین β2 (β2m) یو ثابت چپیرون پروټین دی.یوځل چې په Endoplasmic reticulum کې راټول شي، HLA د پیپټایډ لیګنډ 50 په نشتوالي کې بې ثباته وي.د پیپټایډ پابندۍ نالی د خورا پولیمورفیک او غیر جوړښت شوي α1 او α2 ډومینونو لخوا په غیر پیپټایډ فارم کې او په نسبتا لږ پولیمورفیک α351 ډومینونو کې رامینځته کیږي.د IFNα په شتون کې، موږ دوه HLA-A کمپلیکسونه وموندل: یو د HMGA1 او H2B (شکل 5، جدول S3) سره اړیکه لري او بل یې د MDN1، LRCH4 او H2B سره اړیکه لري (شکل 6).
IFNα د H2B (H2BFS) او HMGA1 سره د HLA-A متقابل عمل شبکه هڅوي.(A) 2D پلاټ (په سیم-XL سافټویر کې رامینځته شوی) په H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس کې د متقابل عمل مختلف ډولونه انځوروي: انټر لینک (نیلي) ، انټر لینک (سور) او واحد لینک (تور)..د مختلف پیژندنې ډومینونه د رنګ کوډ شوي 32 دي: H2B (هیسټون؛ 2-102) او MHC-I (MHC_1؛ 25-203، ګروپ C1؛ 210-290 او MHC_I_C؛ 337-364).د کراس لینک حد په 3.5 کې ټاکل شوی.ډاټ پلاټونه د H2B (B) او HMGA1 (C) سره د HLA-A تعامل ځایونه په ګوته کوي ، او همدارنګه د K یا S متقابل عمل سایټونه د دوه پیپټایډونو ترمینځ.په انځور کې، د کراس لینک سکور حد 3.0 ته ټاکل شوی.(D) د پروټینونو ترمنځ اړیکې د PyMOL پروګرام کې د H2B، HLA-A، او HMGA1 پروټینونو جوړښتونو کې ښودل شوي.دا جوړښتونه د Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) په کارولو سره ماډل شوي او د H2B، HLA-A او HMGA1 پروټینونو لپاره د نمونې جوړښتونه په ترتیب سره 1kx552، 1kj349 او 2eze55 وو.
IFNα د H2B (H2BFS)، MDN1 او LRCH4 سره د HLA-A تعامل شبکه هڅوي.(A) Intramolecular (red) او intermolecular (blue) کراس لینکونه په 2D متقابل نقشه کې وړاندې شوي (د SIM-XL سافټویر کې رامینځته شوي) د MDN1 سره د یوې دایرې په توګه ښودل شوي.د کراس لینک حد په 3.5 کې ټاکل شوی.د مختلف هویتونو ډومینونه د رنګ کوډ شوي 32 دي: H2B (هیسټون؛ 2-102)، MHC-I (MHC_1؛ 25-203، ګروپ C1؛ 210-290 او MHC_I_C؛ 337-364) او LRCH4 (LRR_8 (68-126)، LRR_8 (137–194) او CH (535–641)).(B) د پروټینونو ترمنځ اړیکې د PyMOL پروګرام کې د H2B، HLA-A، LRCH4، او MDN1 پروټینونو جوړښتونو کې ښودل شوي.دا جوړښتونه د Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) په کارولو سره د نمونې جوړښتونو 1kx552، 1kj349، 6hlu62 او 6i2665 سره د H2B، HLA-A، LRCH4 او MDN1 پروټینونو لپاره ماډل شوي، په ترتیب سره.د ډاټ پلاټ د HLA-A لپاره د H2B (C)، LRCH4 (D)، او MDN1 (E) سره د K یا S متقابل عمل سایټونه ښیې.د پلاټونو لپاره، د کراس لینک سکور حد 3.0 ته ټاکل شوی و.
د جینوم بشپړتیا ساتلو سربیره، هیسټون H2B د لیږد په تنظیم کې هم دخیل دی.د H2B پروټین د مرکزي هسټون ډومین (HFD) څخه جوړ دی چې د دریو α-helices لخوا جوړ شوی چې د لوپس او د C-ټرمینل tail 41,52 لخوا جلا شوی.د H2B سره ډیری تعامل په α1 هیلکس کې واقع کیږي، کوم چې د HFD هیټروډیمر (Fig. 5A,B) سره ټریمریزیشن چمتو کوي.که څه هم lysins د DNA په پابندۍ کې دخیل دي، ځینې lysins د بدیل acetylation یا methylation سایټونه هم دي.د مثال په توګه، د H2B څخه پاتې شوي K43، K46، او K57 په مستقیم ډول د DNA پابندۍ کې ښکیل ندي، مګر د لیږد څخه وروسته د مختلفو بدلونونو هدف دي.په ورته ډول، په H2B کې K44، K47، او K57 پاتې شونه کیدای شي د IFNα په شتون کې یو بدیل رول ولوبوي، په شمول د نورو پروټینونو سره تعاملات (انځور 5A، B).برسېره پردې، extrachromosomal هسټون H2B د مختلفو حجرو ډولونو کې د معافیت غبرګون فعالوي، د سایټوسولیک سینسر په توګه کار کوي ترڅو د دوه اړخیزه DNA (dsDNA) ټوټې کشف کړي چې د انتاني اجنټانو یا زیانمن شویو حجرو څخه اخیستل شوي54.د DNA ویروسونو په شتون کې، د H2B کمښت د IFN-β تولید او STAT154 فاسفوریلیشن مخنیوی کوي.H2B هم پیژندل کیږي چې د نورو اصلي هسټونونو په پرتله ګړندی د نیوکلیوس دننه او بهر حرکت کوي54.د MDN1 او LRCH4 سره د H2B تعامل هم په غوره شوي غیر درملنې نمونو کې لیدل شوي.موږ وموندله چې HLA-A د H2B سره په ټولو دریو IFNα - درملنې نمونو کې او په یوه نه درملنه شوي تکرار نمونو کې اړیکه درلوده.دا ډاټا د H2B رول په بدیل فیزولوژیکي فعالیت کې د لیږدونې مقرراتو څخه خپلواک منعکس کوي.
HMGA1 (د لوړ خوځښت ګروپ AT-Hook 1)، یو کوچنی نیوکلیوپروټین چې د ناروغۍ هڅوونکي امینو اسیدونو کې بډای دی، د HLA-A سره په اړیکه کې پیژندل شوی.دا یو تیزابي C-ټرمینل لکۍ او درې جلا DBDs لري چې د AT hooks په نوم یادیږي ځکه چې دوی په dsDNA55,56 کې د AT بډایه سیمې کوچنۍ نالی سره تړلي دي.دا پابند کول د DNA د منحل یا مستقیم کیدو لامل کیږي ، د کینونیکي لیږد فکتورونو ته اجازه ورکوي چې د دې توافق ترتیب ته لاسرسی ومومي.داسې انګیرل کیږي چې د C-ټرمینل دم د پروټین - پروټین تعاملاتو او د لیږد فکتورونو په استخدام کې دخیل وي ، ځکه چې د C-ټرمینل حذف کولو متقابل عمل نشي کولی د لیږد پیل پیل کړي 57.سربیره پردې، دا ډومین ډیری ساتل شوي فاسفوریلیشن سایټونه لري چې د کیناسیس 58 لپاره سبسټریټ پیژندل کیږي.موږ د HLA-A او H2B تعاملات د HMGA1 سره د C-ټرمینل ډومین څخه بهر لیدلي، وړاندیز کوي چې د C-ټرمینل ډومین په عمده توګه د لیږد فکتور پابندۍ لپاره کارول کیږي (انځور 5A، C).د HMGA پروټینونه د هسټون H1 سره سیالي کوي ترڅو د اډاپټر DNA ته پابند شي، په دې توګه د لاسرسي زیاتوالی57.په ورته ډول، داسې ښکاري چې HMGA د هسټون H2B سره د لینکر DNA سره د هسټون H1 سره سیالي کې اړیکه لري.HMGB1 په ډینډریټیک حجرو کې د HLA-A، -B، او -C څرګندونه هڅوي، چې د دوی د فعالولو لامل کیږي، مګر د HMG او HLA ترمنځ تعامل مخکې نه راپور شوی.موږ وموندله چې HMGA1 د HLA-A د α1 او α3 ډومینونو سره تعامل کوي، د دې 3 DBD (شکل 5A,C) څخه بهر ډیری متقابل عمل سره.زموږ په لاسونو کې، HLA-A وموندل شو چې په نیوکلیوس کې ځایي شوی (ډیټا نه ښودل شوي)، او دا چې H2B او HMGA1 هم په نیوکلیوس کې شتون لري، دا تعامل احتمال لري په نیوکلیوس کې واقع کیږي.د H2B، HLA-A، او HMGA1 ترمنځ اندازه شوي ځانګړي اضافه په شکل 5D کې ښودل شوي.
د نورو پروټینونو سره د HLA-A ډیری تعاملات د هغې په α1 او α2 ډومینونو او د ګډوډ شوي C-ټرمینل ډومین (انځور 6) کې واقع کیږي.د دې مثالونو څخه په یوه کې، موږ وموندله چې HLA-A د LRCH4 (شکل 6A،D) د ګډوډ شوي N-ټرمینل دم سره اړیکه لري.LRCH4 د TLR4 فعالول او د LPS سایټوکین انډکشن تنظیموي، په دې توګه د طبیعي معافیت غبرګون 60,61 تعدیل کوي.دا یو جھلی پروتین دی چې د نهه لیوسین بډایه تکرار (LRRs) سره او د کالمودولین (CH) هومولوژی شکل په خپل ایکټوډومین کې دی، وروسته د ټرانس میمبرین ډومین (TMD) 60، 62.CH ډومینونه راپور شوي چې د پروټین - پروټین تعامل منځګړیتوب کوي 60.د LRR او CH ډومینونو ترمنځ د شاوخوا 300 امینو اسیدونو اوږدوالی نسبتا د لاسرسي وړ دی مګر ګډوډ دی.د پروټین - پروټین شبکې منځګړیتوب او د ویسکولر ټرانسپورټ 63 په توګه د ګډوډ شویو سیمو د فعالیت پراساس، موږ وموندله چې ډیری پروټین تعاملات په ګډوډ سیمو کې واقع کیږي.د MDN1 سره تعاملات د پروټین په اوږدو کې ویشل شوي، په شمول د LRR1، LRR6، CH ډومینونه، او تصادفي سیمې، پداسې حال کې چې H2B په عمده توګه د CH ډومین (انځور 6A، B) پورې تړلی دی.د پام وړ، په هیڅ ډول تعامل کې TMJ شامل نه و، چې د CLMS طریقې ځانګړتیا وړاندیز کوي (شکل 6A، B).
MDN1 هم د HLA-A پروټین شبکې د یوې برخې په توګه پیژندل شوی (شکل 6A).دا د پروټینونو AAA کورنۍ پورې اړه لري (ATPases چې د مختلف فعالیتونو سره تړاو لري).دا ورته N-ټرمینل AAA ډومین دی چې په هیکسامریک حلقه کې تنظیموي او د 60S 64 ribosomal subunit څخه د مجلس فکتور لرې کوي.داسې ښکاري چې dynein64,65,66 ته ورته وي.برسېره پر دې، د Asp/Glu بډایه سیمه د MIDAS ډومین (د فلزي آئن انحصار سایټ) لخوا تعقیب کیږي.د MDN1 لوی اندازې (نږدې 5600 امینو اسیدونو) او د ښه مطالعه شوي پروټینونو سره د هغې محدود هومولوژي له امله، په انسانانو کې د دې جوړښت او فعالیت په اړه لږ څه پیژندل شوي.موږ HLA-A، H2B، او LRCH4 د MDN1 پابند شریکانو په توګه وپیژندل او په PyMol (انځور 6A,B) کې مو د پروټین کمپلیکسونو په توګه د دوی تمایل څرګند کړ.دا درې پروټینونه د AAA ډومین سره اړیکه لري، د ډاینین په څیر لینکر ډومین، او ممکن د MIDAS MDN1 ډومین سره.په یوه مخکیني راپور کې، د بیت پروټینونو تړاو پاکول MDN1 د هسټون H2B67 سره تړلی پروټین په توګه پیژندل شوی.برسېره پردې، یوې وروستي مطالعې د HCT116 حجرو کې د MDN او HLA-B ترمنځ د تعامل راپور ورکړی چې د تړاو پاک شوي ډله ایز سپیکرومیټري کاروي، زموږ د موندنو مالتړ کوي68.د IFNα درملنه شوي نمونو کې د دې پیچلتیا پیژندنه د انټرفیرون سیګنل کولو کې د MDN1 رول وړاندیز کوي.
ځکه چې د HLA جینونه خورا پولیمورفیک دي، موږ د Flo-1 حجرو د RNA ترتیب کولو ډیټا څخه د HLA-A، -B، او -C نقشه کولو ترتیب لوستل (ډاټا نه ښودل شوي).د پیپټایډ سلسله چې د ترتیب لوستلو سره مطابقت لري د HLA-A، -B، او -C ترمنځ په هغو سیمو کې د پام وړ توپیرونه په ګوته کړل چیرې چې کراس تړل شوي پیپټایډونه په HLA-A (شکل S3) کې موقعیت لري.برسېره پر دې، موږ د H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 پروټینونو سره د HLA-B/C مالیکولونو د پروټین څخه تر پروټین کراس لینک نه دی لیدلی.دا وړاندیز کوي چې د HLA-A، MDN1، LRCH1 او HMGA1 ترمنځ د پروټین تعامل د HLA-A ځانګړی دی.برسېره پردې، د غیر کراس لینک شوي نمونو پروټومیک تحلیل (جدول S4) ښودلې چې HLA-A د HLA-B یا HLA-C په پرتله لوړ ترتیب پوښښ لري.د HLA-A لپاره پیژندل شوي پیپټایډونه د IFNα درملنه شوي او نه درملنه شوي نمونو کې په شدت کې لوړ وو.
د دې لپاره چې ډاډ ترلاسه شي چې دلته پیژندل شوي تعاملات په نږدې ځای کې د دوه پروټینونو د غیر ځانګړي کراس لینک کولو له امله ندي، موږ نور د دوه نوي HLA-A متقابل عمل فکتورونه د شریک معافیت ارزونې ترسره کولو سره تایید کړل.د HLA-A تعامل د MDN1 او H2B سره په دواړو IFNα - درملنه شوي او نه درملنه شوي Flo-1 حجرو کې کشف شوي (شکل 7، شکل S4).موږ تایید کړه چې HLA-A د H2B لخوا په معافیتونو کې نیول شوی او دا اتحادیه د IFNα درملنې له امله وه ځکه چې HLA-A د غیر درملنې حجرو څخه د معافیتي نمونو کې غیر حاضر و (شکل 7A).په هرصورت، زموږ ډاټا وړاندیز کوي چې IFNα په توپیر سره HLA-A د H2B او MDN1 پابند تنظیموي.IFNα د H2B او HLA-A ترمنځ اړیکه هڅوي، مګر د MDN1 سره یې اړیکه کموي.موږ وموندله چې MDN1 په کنټرولونو کې د HLA-A سره تړاو درلود، او د IFNα اضافه کول دا تعامل د IFNα (شکل 7B، C) لخوا د MDN1 انډکشن څخه خپلواک کم کړی.برسېره پردې، د HLA-A معافیت H2B په A549 حجرو (انځور S4) کې نیول شوی، وړاندیز کوي چې دا تعامل د حجرو ډول څخه خپلواک دی.یوځای اخیستل شوي، دا پایلې د H2B او MDN1 سره د HLA-A د انټرفیرون منځګړیتوب ملاتړ کوي.
HLA-A د H2B او MDN1 ګډ پاکوي.نمایندګي انډوجینس H2B (A) او MDN1 (B) امونابلاټس د IFNα درملنه شوي Flo-1 حجرو څخه معافیت شوي او د اشاره شوي انټي باډیز لپاره تحقیقات شوي.موږک او خرگوش IgG د منفي کنټرول په توګه کارول شوي.(C) د مختلف انټيجنونو نسبي مقدار (انپټ) د امیونو بلاټونو لخوا د ښودل شوي انټي باډونو په وړاندې د تحقیقاتو لخوا ښودل شوي، β-actin د بار کولو کنټرول په توګه کارول کیده.
د یو له انټرفیرون هڅول شوي خورا معتبر کراس سره تړلي شبکې ساختماني ملکیتونه، H2B-HLA-A-HMGA1، تحقیق شوي.موږ د مالیکولر ډینامیک ماډلینګ د بدیل طریقې په توګه کارولی ترڅو پدې پیچلتیا کې دخیل پروټینونو رامینځته شوي متحرکاتو پوهیدو لپاره (8 شکل).د CLMS ډیټا څخه انعکاس د H2B، HLA-A، او HMGA1 پروټینونو د مختلف شکلونو احتمال وړاندیز کوي.له همدې امله، لاندې احتمالي کمپلکسونه په محلول منځني ډول ماډل شوي: H2B-HLA-A، HMGA1-HLA-A، او H2B-HLA-A-HMGA1.د MOE (مالیکولر عملیاتي چاپیریال؛ کیمیاوي کمپیوټري ګروپ Inc.، مونټریال، کیوبیک، کاناډا) کڅوړې په کارولو سره د پروټین - پروټین لومړني ډاکینګ سکرین د ممکنه موافقتنامې وړاندیز وکړ چې د دې پروټینونو ترمینځ توپیر لري (انځور 8A).د ډاکینګ پروټین کمپلیکس لید څو متقابل عملونه او احتمالي جوړښتونه په ګوته کړي (شکل 5A, 8).په دې توګه، یو احتمالي جوړښت په 8A شکل کې ښودل شوی (د لیبل شوي کراس لینکونو سره) او دا د MD ماډلینګ پایپ لاین په کارولو سره نور ارزول شوی.برسېره پردې، د H2B یا HMGA1 د HLA-A سره تړل د HLA-A لپاره د H2B لوړ تړاو په ګوته کوي (انځور 8A).
د H2B (H2BFS) -HLA-A، HMGA1-HLA-A، او H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکسونو ترمنځ د ممکنه شبکو جوړښتي تحرک.(A) کیڼ تخته د 2D نقشه ده (د SIM-XL سافټویر کې رامینځته شوې) د انټرمولیکولر (سور) او انټرمولیکولر (نیلي) کراس لینکونو (کراس لینک کټ آف 3.5 ته ټاکل شوی).برسېره پردې، د کراس سره تړل شوي پاتې شوي پیژندل شوي د H2B، HLA-A، او HMGA1 پروټینونو جوړښتونو باندې لیبل شوي.د دې پروټینونو اړوند جوړښتونه د MOE په بسته کې پلي شوي د ډاکینګ پایپ لاین په کارولو سره ایستل شوي.ښکته کیڼ تخته د H2B-HLA-A او HMGA1-HLA-A کمپلیکسونو مختلف ممکنه جوړښتونه ښیې چې د مختلف پروټین-پروټین پابندۍ سره تړاو لري (GBVI/WSA dG؛ kcal/mol).(ب) د هر پروټین جوړښت لپاره د اټومي موقعیتونو معیاري انحراف (RMSD) (د هایدروجن اتومونو پرته).(C) د انټرمولیکولر پروټین - پروټین هایدروجن بانډ تعامل د مختلف سمولیټ کمپلیکسونو څخه د ځانګړي تعامل په پام کې نیولو سره د ≥ 10 ns موده.د H-بانډ ډونر-منونکي کټ آف فاصله 3.5 Å ته ټاکل شوې وه، او د بسپنه ورکوونکي-H-منونکي کټ آف زاویه ≥ 160 ° – 180 ° ته ټاکل شوې وه.(D) د لیبل شوي پاتې شونو د HLA-A پروټین - پروټین تعاملات د خپلو اړوندو شریکانو سره، د ≥ 20 ns پراخوي، د ډمي HLA-A-H2B او HLA-A-HMGA1 کمپلیکسونو څخه استخراج شوي.د پروټین جوړښتونه د 100 ns MDS اوسط جوړښت استازیتوب کوي.(E) د HLA-A-H2B او HLA-A-HMGA1 کمپلیکسونو ترمنځ تعامل د دوه پیپټایډونو ترمینځ د K یا S متقابل عمل سایټ پراساس د 100 ns څخه ډیر د H2B-HLA سمولیشن لخوا تعقیب شوي تعاملاتو په پرتله.کمپلیکسونه /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.د کراس لینکونو ارزونې لپاره د حد ارزښت 3.0 ته ټاکل شوی و، او د MDS څخه ځانګړي تعاملات چې ≥ 10 ns په پام کې نیول شوي و.د پروټین جوړښتونه د BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) او مالیکولر عملیاتي چاپیریال (MOE؛ کیمیکل کمپیوټري ګروپ Inc.، مونټریال، کیوبیک، کاناډا) کڅوړو په کارولو سره لیدل شوي.
د وخت په تیریدو سره د HLA-A مالیکولونو ثبات (معیاري انحراف؛ RMSD یا معیاري انحراف؛ RMSF) په ګوته کړه چې په کمپلیکسونو کې د H2B یا HMGA1 پروټینونو شتون HLA-A ثبات کړی (شکل 8B، شکل S5).د HMGA1 پروټین د HLA-A B2M سایټ سره په کلکه تړل کیږي، په HLA-A-HMGA1 یا H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس کې د HLA-A امینو اسیدونو ثبات هڅوي (شکل 8B، شکل S5).په ځانګړې توګه، د HLA پاتې شونه ~ 60-90 او ~ 180-210 د H2B (FIG. 8B) په شتون کې لږ انعطاف وړ موندل شوي.H2B او HMGA1 په H2B-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس کې د HLA-A سره د H2B یا HMGA1 د پابندۍ په پرتله ښه پابند ښودل شوي (شکل 8C,D؛ جدول S5).د هایدروجن بانډینګ (MD ماډل شوي لوړ قبضیت ≥ 10 ns) کې دخیل پاتې شنې په کمپلیکس کې د CLMS متقابل عمل سایټونو (K یا S پاتې شونو) سره سمون لري، دا وړاندیز کوي چې د CLMS لخوا پیژندل شوي تعامل خورا معتبر دي.اعتبار (انځور 8E).په CLMS او MD ماډلینګ کې، د HLA-A پاتې شونه د 190-210 او شاوخوا 200-220 امینو اسیدونو ترمنځ په ترتیب سره د H2B او HMGA1 تړلو لپاره وموندل شول (FIG. 8E).
د پروټین-پروټین تعاملات متحرک ساختماني شبکې جوړوي چې د ځینې محرکاتو په ځواب کې د انټرا سیلولر ارتباط منځګړیتوب کوي.ځکه چې ډیری پروټومیک طریقې د پروټین په ټولیز ثابت حالت کې بدلونونه کشفوي، د پروټین - پروټین متقابل عمل متحرکات د پابندۍ انٹرفیسونو نیولو لپاره اضافي وسیلو ته اړتیا لري، او CLMS یو داسې وسیله ده.د انټرفیرون سیګنالینګ سیسټم د سایټوکین شبکه ده چې حجرو ته اجازه ورکوي چې د چاپیریال رنځجنیک او داخلي رنځولوژیکي سیګنالونو لړۍ ته ځواب ووایی ، چې د انټرفیرون - انډکیبل پروټینونو فرعي سیټونو شاملولو پایله لري.موږ CLMS پلي کړ ترڅو معلومه کړو چې ایا د پروټین - پروټین متقابل عمل د انٹرفیرون هڅول شوي پروټینونو پینل ترمینځ پیژندل کیدی شي.د نړیوال پروټین کراس لینک کولو تحلیل د انټرفیرون - ځواب ویونکي Flo-1 سیل ماډل کې د پروټین کمپلیکسونو نیولو لپاره کارول شوی و.د غیر کراس تړل شوي او کراس تړل شوي حجرو څخه د ټریپټیک پیپټایډونو استخراج د پیپټایډ شمیرنې ، د لارې بډایه کولو ، او د ټاکل شوي LFQ شدت سره د پیپټایډ اوږدوالي توزیع ته اجازه ورکوي.کینونیکي انټرفیرون - انډکیبل پروټینونه د مثبت داخلي کنټرول په توګه پیژندل شوي، پداسې حال کې چې د کانونیکي انټرفیرون - انډولیبل پروټینونو لکه MX1، UP18، OAS3 او STAT1 نوي انټرمولیکولر او انټرمولیکولر کراس پورې تړلي اضافه لیدل شوي.په کاري ساحو کې بیلابیل جوړښتي ځانګړتیاوې او تعاملات څیړل شوي.
د HLA-A، MDN1 او H2B ترمنځ متقابل عمل په Flo-1 او A549 حجرو کې د IFNα سره درملنه شوي او نه درملنه شوي د معافیتونو په واسطه کشف شوي.زموږ پایلې په ګوته کوي چې HLA-A د H2B سره په IFNα پورې تړلي ډول سره پیچل کیږي.زموږ کار د دې دوه کمپلکسونو ګډ ځایی کولو نور سپړنې لپاره په زړه پورې لاره څرګندوي.دا به هم په زړه پورې وي چې د سیل لینونو پینل ته د CLMS طریقه پراخه کړئ ترڅو د حجرو ډول - خپلواک انټرفیرون - منځګړیتوب پروټین تعاملات وپیژني.په نهایت کې ، موږ د H2BFS-HLA-A-HMGA1 کمپلیکس کې دخیل پروټینونو رامینځته شوي متحرکاتو پوهیدو لپاره د MD ماډلینګ د بدیل طریقې په توګه کارولی ، کوم چې د انټرمولیکولر او انټرمولیکولر کراس خبرې تعقیبوي.د CLMS ډیټا څخه انعکاس د H2BFS، HLA-A، او HMGA1 پروټینونو د مختلف شکلونو احتمال وړاندیز کوي.د دې ډاکینګ پروټین کمپلیکسونو تر مینځ ممکن مختلف تعاملات د CLMS ډیټاسیټ کې لیدل شوي ورته ورته متقابل عمل څرګند کړ.زموږ د میتود یو له اصلي ځواک څخه دا دی چې دا د لوړ پولیمورفیک جینونو تعامل اسانه پیژندلو ته اجازه ورکوي لکه HLA، نو دا به په زړه پورې وي چې د HLA هاپلوټائپ ځانګړي پروټینونو تعامل مطالعه کړئ چې په بل ډول مطالعه کول ستونزمن دي.په ګډه اخیستل شوي، زموږ ډاټا ښیي چې CLMS د انټرفیرون هڅول شوي سیګنالینګ شبکو په اړه زموږ د پوهاوي پراخولو لپاره کارول کیدی شي او د تومور مایکرو چاپیریال کې د ډیرو پیچلو انټر سیلولر سیسټمونو مطالعې لپاره اساس چمتو کوي.
Flo-1 حجرې د ATCC څخه ترلاسه شوي او په DMEM (Gibco) کې ساتل شوي چې د 1٪ پینسلین/سټریپټومیسین (انویټروجن) سره ضمیمه شوي، 10٪ د جنین بووین سیرم (Gibco) او په 37°C او 5% CO2 کې زیرمه شوي.انکیوبیشن.حجرې د IFNα14 سره د درملنې دمخه د 70-80٪ ترکیب ته وده کړې (د اډینبورګ پروټین تولید تاسیساتو لخوا جوړ شوی).نور ټول کیمیاوي توکي او ریجنټونه د سیګما الډریچ څخه پیرودل شوي پرته لدې چې بل ډول یادونه وشي.
د Flo-1 حجرې په 6 څاه ګانو کې کرل شوي او بله ورځ حجرې د 10 ng/ml IFNα14 سره د 24 ساعتونو لپاره نږدې 80٪ ترکیب کې درملنه شوې.حجرې درې ځله د PBS سره مینځل شوي او په تازه چمتو شوي DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO کې منحل شوي) سره په PBS کې د 5 دقیقو لپاره په 37 سانتي ګراد کې د 0.5 ملي میتر وروستي غلظت لپاره تړل شوي.د DSS کراس لینکینګ عکس العمل د PBS سره بدل شو او پاتې DSS په PBS کې د 20 mM Tris (pH 8.0) په اضافه کولو سره د 15 دقیقو لپاره په 37 ° C کې وچول شو.حجرې د سکریپ په واسطه راټول شوي او په ټیټ پابند ټیوبونو (اکسیجن) کې راټول شوي.
د حجرې ګولۍ د 300 µl یوریا لیسیز بفر (8 M یوریا، 0.1 M Tris، pH 8.5) سره د 30 دقیقو لپاره د خونې په حرارت درجه کې د ځینې وختونو د ټکولو سره لیس شوی.ټول سنټرفیوګریشن مرحلې په 14,000 xg کې په 8°C کې ترسره شوې.د 10 دقیقو لپاره لیسټیټ سینټرفیوج کړئ او سپرناټینټ نوي ټیوب ته انتقال کړئ.پاتې روښانه ذرات د دویم لیسیز بفر په 150 μl (2 M یوریا، 2% (w/v) SDS (سوډیم ډوډیسیل سلفیټ)) کې د 30 دقیقو یا ډیر لپاره تر هغه وخته پورې حل شوي چې یو همجنس آبی محلول ترلاسه شوی.lysate د 20 دقیقو لپاره سینټرفیوج شوی او سپرناټینټ په تیرو مرحلو کې ترلاسه شوي لیسیټ سره مخلوط شوی.د پروټین غلظت د مایکرو پلیټ پروسیجرونو لپاره د تولید کونکي لارښوونو سره سم د مایکرو BCA ارزونې (Thermo Fisher Scientific) په کارولو سره ارزول شوی.نمونې په چټکۍ سره په مایع نایتروجن کې کنګل شوي او په -80 درجو کې زیرمه شوي.
نږدې 100 μg محلول شوي کراس تړل شوي پروټین د ترمیم شوي فلټریشن نمونې چمتو کولو پروتوکول (FASP) په کارولو سره پروسس شوي لکه څنګه چې د Wisniewski et al لخوا تشریح شوي.69 په لنډه توګه، پروتین د 200 µl یوریا بفر (8 M یوریا په 0.1 M Tris کې، pH 8.5) سره نښلول شوی، وورټکس شوی او نیمایي شوی.ټول سنټرفیوګریشن مرحلې په 14,000 xg کې په 25 ° C کې ترسره شوي.د کراس سره تړلي پروټین لیسیټ لومړۍ نیمایي د 10 kDa مایکروکون سینټرفیوګال فلټر وسیلې ته لیږدول شوی و چې د الټراسیل - 10 جھلی (مرک) سره مجهز شوی و ، وروسته د 25 دقیقو لپاره په فلټر کې سینټرفیوګریشن.بیا د پروټین دویمه نیمه برخه فلټر ته اضافه کړئ او ورته ګامونه تکرار کړئ.د پروټین بیا رغونه د یوریا بفر کې د 100 μl 17 mm tris (2-carboxyethyl) فاسفین هایدروکلورایډ (TCEP) په اضافه کولو سره ترسره شوه.بیا رغونه په 600 rpm کې د 30 دقیقو لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې په ترمامیکسر کې اچول شوې.برسېره پردې، کالم سینټرفیوژ شوی و او د کراس سره تړلی کم شوی پروټین د یوریا بفر کې د 100 μl 50 mM iodoacetamide په کارولو سره الکیلیټ شوی و.د الکیلیشن عکس العمل په تیاره کې د 20 دقیقو لپاره د خونې په حرارت درجه کې ترسره شو.کالم وګرځوئ، د کالم دیوالونه 3 ځله د 100 μl یوریا بفر سره ومینځئ، او بیا سینټرفیوج.ورته عملیات د 100 μl د 100 mM امونیم بای کاربونیټ په کارولو سره 3 ځله ترسره شوي.د ټریپسین کولو دمخه، د راټولولو ټیوب په نوي سره بدل کړئ.د هضم بفر اضافه کړئ چې 50 mM امونیم بای کاربونیټ لري او 1 μl ټریپسین په ټریپسین بفر (پرومیګا) کې ضعیف شوي.د ټریپسین او پروټین تناسب په 1:33 کې ساتل شوی و، او د هضم عکس العملونه د شپې په 37 درجې سانتي ګراد کې په مرطوب خونه کې ساتل شوي.کراس لینک شوي پیپټایډ د 25 دقیقو لپاره د سینټرفیوګریشن په واسطه له فلټر څخه ایستل شوی و.د پیپټایډ بیا رغونه په فلټر کې د 50 μl 0.5 M NaCl په اضافه کولو سره ښه شوه، وروسته د 25 دقیقو لپاره سینټرفیوګریشن.
د C18 مایکرو سپن کالمونه (د هارورډ اپریټس) د کراس سره تړل شوي ټریپټیک پیپټایډونو د مینځلو لپاره کارول شوي وو چې د بوچل او 70 لخوا تشریح شوي پروتوکول په وړو بدلونونو سره.په لنډه توګه، د C18 سپن کالمونه د 0.1% فارمیک اسید (FA) په acetonitrile (AcN) (Merck) کې او د 0.1% FA دوه مینځلو سره فعال شوي.کالم د 0.1% FA سره د 15 دقیقو لپاره هایډریټ شوی.نمونې په سپن کالمونو کې بار کړئ او د 0.1% FA سره 3 ځله ومینځئ.له مینځه وړل شوي پیپټایډونه په ترتیب سره د 50٪، 80٪ او 100٪ AcN په کارولو سره په 0.1٪ FA کې د ګام په لور تدریجي سره جلا شوي.نمونې په SpeedVac Plus Concentrator (Eppendorf) کې وچې شوې تر څو چې پاتې مایع په بشپړه توګه ورک شي.الیټ شوي پیپټایډونه په 100 μl کې د 0.08٪ trifluoroacetic اسید په 2.5٪ AcN کې حل شوي او غلظت یې په NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) کې اندازه شوي.په هر نمونه کې نږدې 1 μg کراس لینک شوي پیپټایډ د LC-MS/MS سیسټم ته داخل شوی.
کراس تړل شوي پیپټایډونه په الټی میټ 3000 RSLCnano LC سیسټم (Thermo Scientific) کې جلا شوي وو چې د اوربیټراپ ایکسپلوریس 480 ډله ایز سپیکرومیټر (Thermo Scientific) سره وصل و.سره تړلي پیپټایډونه په 300 µm ID کې راټول شوي، 5 mm اوږد µ-مخکی کالم C18 کیپچر کالم د C18 PepMap100 شربت او 5 µm PepMap شربت (Thermo Scientific) سره ډک شوي.د پمپ جریان په 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid په 2.5% AcN کې منحل شوي بار کړئ.سره تړلي پیپټایډونه په تحلیلي فیوز شوي سیلیکا کالم کې د 75 μm داخلي قطر او 150 mm اوږدوالي سره جلا شوي ، د 2 μm PepMap شربت (Thermo Scientific) سره ډک شوي.د ګرځنده پړاوونو A او B په ترتیب سره په اوبو کې 0.1% FA او په acetonitrile کې 0.1% FA لري.تدریجي په 2.5٪ B پیل کیږي او په 90 دقیقو کې په 40٪ B پورې په خطي توګه لوړیږي، بیا په راتلونکو 2 دقیقو کې 90٪ B ته.د ګرځنده مرحلې ترکیب د 10 دقیقو لپاره په 90٪ B کې ساتل شوی و او بیا په 2 دقیقو کې 2.5٪ B ته په خطي توګه کم شوی.کالم د راتلونکي دورې څخه د 8 دقیقو لپاره په 2.5٪ B کې انډول شوی و.د تحلیلي کالم څخه جلا شوي کراس پورې تړلي پیپټایډونه د نانو الیکټرو سپری آیونائزیشن (NSI) سرچینې کې ionized شوي او په Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific) کې داخل شوي.
Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer د مثبت ډیټا ارتباط حالت کې کار کوي.یو بشپړ سکین د 120,000 په ریزولوشن کې د برخې په حالت کې ترسره شو چې له m/z 350 Th څخه m/z 2000 Th پورې د رینج ترتیباتو سره.د نورمال شوي AGC هدف 300٪ ټاکل شوی و چې د 50ms د اعظمي اندازې وخت سره.د پیپټایډونو لپاره د مونویسوټوپیک چوټي کشف رامینځته شوی.د محدودیت آرامۍ پیرامیټر ریښتیا ټاکل کیږي که چیرې ډیر لږ مخکیني وموندل شي.د مخکیني لږترلږه ionic ځواک 5.0e3 ته ټاکل شوی و او د مخکینۍ چارج حالتونه تر +8 پورې په تجربو کې شامل شوي.
د ډیټا ارتباط حالت کې د لوی سکینونو ترمینځ د دورې وخت 2.5 ثانیو ته ټاکل شوی.متحرک ډله ایز اخراج د مخکینۍ آیون له لومړۍ ټوټې کیدو وروسته 20s ته ټاکل شوی و.د مخکینۍ جلا کولو کړکۍ 2th ته ټاکل شوې وه.د عادي ټکر انرژي ډول د ثابت ټکر انرژي حالت سره د ډیټا انحصار MS/MS سکین کې غوره شوی.د ټکر انرژي 30٪ ته ټاکل شوې.د Orbitrap ریزولوشن 15,000 ته ټاکل شوی او د AGC هدف 100٪ ته ټاکل شوی.د ګمرکي اعظمي انجیکشن وخت 60 ملی ثانیو ته ټاکل شوی.
مخکې له دې چې په کراس تړل شوي نمونو کې د پروټین - پروټین شبکې تعقیب کړي، موږ خام فایلونه د MaxQuant بسته (نسخه 1.6.12.0) 26,27 په کارولو سره پروسس کړل ترڅو په نمونو کې د موندلو وړ پیپټایډز/پروټینونه وپیژنو.برسېره پردې، ورته پروټومیک تحلیلونه په غیر تړل شوي Flo-1 نمونو کې ترسره شوي چې د IFNα سره درملنه شوي او نه درملنه شوي.د MS/MS ډیټا په UniProt انساني ډیټابیس (www.uniprot.org) کې پلټل شوي (د اګست په 12، 2020 اپلوډ شوی، 75,093 داخلې لري) د جوړ شوي لټون انجن اندرومیډا27 په کارولو سره.لټون پرته له دې چې د انزایم ځانګړتیا او د ډیمایډیشن (N، Q) او اکسیډریشن (M) مختلف تعدیلات په ګوته کړي ترسره شوي.مخکینۍ ډله ایز زغم په 20 ppm او د محصول آیونونه په 0.02 Da کې ټاکل شوي.لومړنی او اعظمي ډله انحراف 10 ppm ته ټاکل شوی.د پیپټایډ اعظمي اندازه په 4600 Da کې ټاکل شوې وه او د ترتیب ورته والی د 7 او 25 امینو اسیدونو (aa) ترمنځ ټاکل شوی و.نور احصایوي تحلیل د Perseus پروګرام (نسخه 1.6.10.45) په کارولو سره ترسره شوي.د پروټین مینځپانګه د پروټین د سپیکٹرل شدت نورمال کولو سره محاسبه شوې (LFQ شدت؛ غیر لیبل شوی مقدار) 27 او د شدت ارزښتونه Log2 ته بدل شوي.په R (v 4.1.2).د لارې د غني کولو تحلیل د IFNα درملنې شوي پروټینونو لپاره د Reactome pathway ډیټابیس په کارولو سره ترسره شوی چې د غیر درملنې نمونو په پرتله څلور ځله فعال شوي.
د LC-MS/MS لخوا څارل شوي پروټین کمپلیکسونو د لیسین (K) یا سیرین (S) ځانګړي کیمیاوي کراس لینکونو پیژندنه د کراس تړل شوي پیپټایډز (SIM-XL) 29 لپاره د سپیکٹروسکوپي پیژندنې ماشین (SIM-XL) په کارولو سره ترسره شوې.لومړی، د انټرفیرون سره تړلي (IFN) د DNA د زیان مقاومت لاسلیک (IRDS) جینونو تر مینځ ممکنه تعامل د IRDS پروټین ډیټاسیټ په کارولو سره تحقیق شوي چې په Padariya et al.28 کې تشریح شوي.د ټول انسان یونیپروټ د ټولو شرایطو او تکرارونو سکرین کول له کمپیوټري پلوه خورا جدي دي ، نو د IFNα درملنې تکرارونو پروړاندې د انسان ټول یونیپروټ ډیټابیس (www.uniprot.org) (د 12 اګست 2020 ډاونلوډ شوی ، 75,093 داخلې لري).د لوړ باور متقابل عمل لپاره یو له فلټرونو څخه.ترلاسه شوي دا لوړ اهمیت تعاملات پراخ شوي او په ټولو تکرارونو او شرایطو کې ازمول شوي.
په SIM-XL کې، DSS د کراس لینکر (XL) لپاره کارول شوی و او د XL وزن بدلون او د وزن بدلون بدلون په ترتیب سره 138.06 او 156.07 ته ټاکل شوی و.لاندې د کراس لینک کولو عکس العمل سایټونه په پام کې نیول شوي: KK، KS او KN-TERM، پرته له راپور ورکوونکي ions.دواړه مخکینۍ او ټوټې ppm 20 ته ټاکل شوي او د Xrea حد 0.15 ته ټاکل شوی.ټریپسین په بشپړ ډول مشخص وګڼل شو، او د لوړې انرژۍ C-trap (HCD) ټوټه کولو طریقه پلي شوه.د XCorr متحرک DB کمولو حد او د ډینامیک DB کمولو لپاره د پیپټایډونو لږترلږه شمیر په ترتیب سره 2.5 او 2 ته ټاکل شوي.نور پارامترونه عبارت دي له: د مونوسوټوپ احتمال او د لوړ اتفاق کټ آف، لږ تر لږه 4 AA پاتې شونه په هر سټنډ او اعظمي تار چارج، او د ورک شوي ویشلو 3 اعظمي.پایله شوې 2D نقشې په (SIM-XL) کې تحلیل شوي او د xQuest28 ګرافیکي نمایش د 2D نقشو جوړولو لپاره کارول شوي.د پروټین په جوړښتونو کې د پروټین کراس لینکونه په PyMol (PyMOL مالیکولر ګرافیک سیسټم، نسخه 2.0 Schrödinger, LLC) کې چمتو شوي.
د پروټین ماډل جوړښتونه د Phyre2 سرور (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 11 په کارولو سره د هومولوژي ماډلینګ اصولو په کارولو سره رامینځته شوي او د "پټ مارکوف میتود" پلي کول.Phyre2 د پیژندل شوي پروټین جوړښتونو سره د ترتیب ترتیب پراساس ماډل جوړښتونه رامینځته کوي.د H2BFS، HLA-A، HMGA1، LRCH4، او MDN1 پروټینونو لپاره، د ټیمپلیټ جوړښتونه 1kx552، 1kj349، 2eze55، 6hlu62، او 6i2665 کارول شوي.سربیره پردې، د AlphaFold71 MX1، UBP18 او ROBO1 جوړښت هم په پام کې نیول شوی.د پروټین جوړښت د BIOVIA Discovery Studio Visualizer کڅوړه (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) او د مالیکولر عملیاتي چاپیریال کڅوړه (MOE؛ کیمیکل کمپیوټري ګروپ Inc.، مونټریال، کیوبیک، کاناډا) په کارولو سره لیدل شوی.