347 12.7*1.24mm د سټینلیس سټیل کویل شوي ټیوبینګ ، د همغږي الیکټروسټاټیک کنډنسیشن مالیکول میکانیزم او د α-synuclein او تاو جمع کول

د Nature.com لیدلو لپاره مننه.تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).برسېره پردې، د روان ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کوو.
سلایډونه په هر سلایډ کې درې مقالې ښیې.د هر سلایډ له لارې حرکت کولو لپاره شاته او بل بټن وکاروئ، یا د سلایډ کنټرولر بټن په پای کې د هر سلایډ له لارې حرکت وکړئ.

347 د سټینلیس سټیل پایپ مشخصات

347 12.7*1.24mm سټینلیس سټیل کویل شوی ټیوب

بهر قطر: 6.00 mm OD تر 914.4 mm OD پورې، اندازه تر 24 "NB پورې شتون لري Ex-Stock، OD اندازه فولادو ټیوبونه شتون لري Ex-Stock

د SS 347 پایپ ضخامت حد: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0.5-12mm) یا غیر منظم اندازه باید د اړتیا سره سم تنظیم شي

ډول: SS 347 بې سیمه پایپونه |SS 347 ERW پایپونه |SS 347 ویلډ شوي پایپونه |SS 347 جوړ شوي پایپونه |د SS 347 CDW ټیوبونه، LSAW پایپونه / سیم ویلډډ / ریډران

فورمه: SS 347 ګردي پایپونه / ټیوبونه، SS 347 مربع پایپونه / ټیوبونه، SS 347 مستطیل پایپ / ټیوبونه، SS 347 کویل شوي ټیوبونه، SS 347 "U" شکل، SS 347 پین کیک کویل، SS 347 Hydras Tubes

اوږدوالی: واحد تصادفي، دوه ګونی تصادفي او د اړتیا وړ اوږدوالی پای: ساده پای، بیول شوی پای، ټریډ شوی

د پای ساتنه: پلاستيکي کیپس |بهر پای: 2B، No.4، No.1، No.8 د سټینلیس فولادو پایپونو لپاره د عکس پای، د پیرودونکو اړتیاو سره سم پای

د تحویلي حالت: انیل شوي او اچار شوي ، پالش شوي ، روښانه انیل شوي ، سړه ایستل شوي

تفتیش، د ازموینې راپورونه: د مل ټیسټ سندونه، EN 10204 3.1، کیمیاوي راپورونه، میخانیکي راپورونه، د PMI ازموینې راپورونه، د لید معاینې راپورونه، د دریمې ډلې تفتیش راپورونه، د NABL تصویب شوي لابراتوار راپورونه، ویجاړونکي ازموینې راپور، غیر ویجاړونکي ازموینې راپورونه

بسته بندي: د لرګیو په بکسونو کې بسته شوي، پلاستيکي کڅوړې، د فولادو پټو بنډل شوي، یا د پیرودونکو غوښتنو سره سم

ځانګړي: د پورته څخه پرته نور اندازه او مشخصات د غوښتنې پراساس تولید کیدی شي

د SS 347 پایپ اندازه حد: 1/2 انچ NB، OD تر 24 انچ پورې

ASTM A312 347: بې سیمه او مستقیم سیم ویلډډ اوسټینټیک پایپ د لوړې تودوخې او عمومي زیان رسونکي خدمت لپاره ټاکل شوی.فلر فلز د ویلډینګ پرمهال اجازه نلري.

ASTM A358 347: بریښنایی فیوژن ویلډډ اوسټینیټ پایپ د زنګ او / یا د لوړې تودوخې خدمت لپاره.معمولا یوازې 8 انچو پورې پایپ دې مشخصاتو ته تولید کیږي.د ویلډینګ پرمهال د فلر فلز اضافه کولو اجازه لري.

ASTM A790 347: بې سیمه او مستقیم سیم ویلډډ فیریټیک/آسټینیټیک (ډوپلیکس) پایپ د عمومي کنسرونکي خدمت لپاره ټاکل شوی ، د فشار د زنګ وهلو په وړاندې مقاومت باندې ځانګړي ټینګار سره.

ASTM A409 347: مستقیم سیم یا سرپل سیوم بریښنایی فیوژن ویلډډ د لوی قطر اسټینیټیک ر lightا دیوال پایپ د 14” څخه تر 30” سایزونو کې دیوالونه Sch5S او Sch 10S د زنګ او / یا لوړ لپاره

ASTM A376 347: د لوړې تودوخې غوښتنلیکونو لپاره بې سیمه austenitic پایپ.

ASTM A813 347: د لوړې تودوخې او عمومي کنسرو غوښتنلیکونو لپاره واحد سیم، واحد یا ډبل ویلډیډ ایسټینیټ پایپ.

ASTM A814 347: د لوړې تودوخې او عمومي زیان رسونکي خدمت لپاره د یخ کار شوي ویلډډ اوسټینیټ پایپ.

347H سټینلیس سټیل پایپونه کیمیاوي جوړښت

د سټینلیس سټیل 347H پایپ میخانیکي ملکیتونه

د سټینلیس سټیل 347H پایپونه فزیکي ملکیتونه

د 347H سټینلیس سټیل پایپ لپاره مساوي درجې

Amyloid alpha-synuclein (αS) مجموعه د پارکینسن ناروغۍ او نورو synucleinopathies نښه ده.په دې وروستیو کې، د تاو پروټین په عمومي ډول د الزایمر ناروغۍ سره تړاو لري د αS رنځپوهنې سره تړاو لري او موندل شوي چې د αS بډایه شمولیتونو کې شریک ځایی کړي، که څه هم د دوو پروټینونو د یوځای کولو مالیکول میکانیزم ناڅرګند دی.موږ دلته راپور ورکوو چې د αS مرحله د مثبت چارج شوي پولی پیپټایډونو لکه تاو سره د الکتروسټټیک پیچلي کنډنسیشن له لارې مایع کنډنسیټونو ته جلا کوي.د پولیکیشنونو لپاره د αS تړاو او د کوګولیشن شبکې د والینس کمیدو نرخ پورې اړه لري، ټوټې د چټک جیلیشن یا یوځای کیدو څخه تیریږي وروسته د ورو امیلایډ جمع کول.د پرمختللو بایو فزیک تخنیکونو سره یوځای کولو سره، موږ وکولای شو چې د مایع مایع αS/Tau پړاو جلا کول مشخص کړو او هغه کلیدي فکتورونه وپیژنو چې د مایع پروټین کنډنسیټ کې دواړه پروټینونه لري د متضاد مجموعو رامینځته کولو المل کیږي.
د جھلیو برخو سربیره، په حجرو کې ځایی جلا کول د پروټین بډایه، مایع په څیر د کثافاتو د جوړښت له لارې هم ترلاسه کیدی شي چې د بایومولیکولر کنډنسیټس یا څاڅکو په نوم یادیږي، د یوې پروسې له لارې چې د مایع - مایع پړاو جلا کولو (LLPS) په نوم پیژندل کیږي.دا څاڅکي د څو اړخیز وختي تعاملاتو لخوا رامینځته کیږي ، معمولا د پروټینونو یا پروټینونو او RNA ترمینځ ، او نږدې په ټولو ژوندیو سیسټمونو کې مختلف دندې ترسره کوي.د LLP وړ وړ پروټینونو لوی شمیر د ټیټ پیچلتیا سلسلې نندارې ته وړاندې کوي چې په طبیعت کې خورا ګډوډ شوي او د بایومولیکولر کنډنسیټس 3,4,5 په جوړښت کې دي.ډیری تجربوي مطالعاتو د پروټینونو انعطاف وړ، ډیری وختونه ګډوډ، او څو اړخیزه ماهیت په ډاګه کړی چې دا مایع لکه کانډینیسټونه جوړوي، که څه هم د ځانګړو مالیکولر ټاکلو په اړه لږ څه پیژندل شوي چې د دې کنډنسیټونو وده او پختتیا کنټرولوي. ریاست.
نوې ډاټا د دې فرضیې ملاتړ کوي چې د پروټین لخوا پرمخ وړل شوي LLPS او په جامد جوړښتونو کې د څاڅکو بدلون ممکن د حجرو اړونده لارې وي چې د نه حل کیدونکي زهرجن مجموعو رامینځته کیدو لامل کیږي چې ډیری وختونه د تخریبي ناروغیو نښه وي.ډیری LLPS سره تړلي داخلي بې نظمۍ پروټینونه (IDPs) چې ډیری وختونه ډیر چارج شوي او انعطاف وړ دي، د اوږدې مودې راهیسې د امیلایډ راټولولو پروسې له لارې د نیوروډیجنریشن سره تړاو لري.په ځانګړې توګه، د بایو مالیکولر IDP کنډنسیټس لکه FUS7 یا TDP-438 یا پروټینونه چې د لوی ټیټ پیچلتیا ډومینونه لري لکه hnRNPA19 د عمر په څیر د جیل په څیر یا حتی جامد شکلونو ته د یوې پروسې له لارې ښودل شوي چې د مایع کولو په نوم یادیږي.مرکبد جامد پړاو لیږد (LSPT) ته د وخت د فعالیت په توګه یا د ژباړې څخه وروسته ځینې بدلونونو یا د رواني پلوه مهم بدلونونو په ځواب کې 1,7.
بل IDP په vivo کې د LLPS سره تړلی Tau دی، یو مایکروټیوبیل پورې تړلی اختلال پروټین دی چې د امیلایډ مجموعه د الزایمر ناروغۍ 10 کې ښکیل شوی مګر په دې وروستیو کې د پارکینسن ناروغۍ (PD) او نورو synaptic اټومي پروټینونو 11، 12، 13 پورې تړاو لري.تاو ښودل شوي چې د مناسب الیکټروسټاټیک تعاملاتو له امله په ناڅاپه توګه د محلول/سایټوپلازم څخه جلا کیږي 14 چې په پایله کې د تاو بډایه څاڅکي رامینځته کیږي چې د الیکټروسټاټیک coacervates په نوم پیژندل کیږي.دا هم لیدل شوي چې دا ډول غیر مشخص تعامل په طبیعت کې د ډیری بایومولیکولر کنډنسیټونو ترشا محرک ځواک دی15.د تاو پروتین په صورت کې، الکتروسټیک جمع کول د ساده مجموعې په واسطه رامینځته کیدی شي، په کوم کې چې د پروټین په مقابل کې چارج شوي سیمې د فاصلې بهیر پیلوي، یا د منفي چارج شوي پولیمرونو لکه RNA سره د تعامل له لارې پیچلي مجموعه.
په دې وروستیو کې، α-synuclein (αS)، یو امیلایډ IDP چې په PD او نورو نیوروډیجینریټیو ناروغیو کې شامل دی په ټولیز ډول د Synucleinopathy17,18 په نوم پیژندل شوی، په سیلولر او حیواني ماډلونو کې ښودل شوي چې د پروټین کنډانسیټ کې د مایع په څیر چلند سره متمرکز شوي.د ویټرو مطالعاتو ښودلې چې αS په عمده ډول د هایدروفوبیک تعاملاتو له لارې د ساده مجموعې له لارې LLPS څخه تیریږي ، که څه هم دا پروسه په غیر معمولي ډول د پروټین لوړ غلظت او په غیر معمولي ډول د اوږدې انکیوبیشن وختونه 19,21 ته اړتیا لري.ایا په vivo کې مشاهده شوي αS لرونکي کنډنسیټس د دې یا نورو LLPS پروسو لخوا رامینځته شوي یوه کلیدي نا حل شوې مسله پاتې ده.په ورته ډول، که څه هم د αS amyloid مجموعه په PD او نورو synucleinopathies کې په نیورونونو کې لیدل شوي، دقیق میکانیزم چې په واسطه یې αS د انټرا سیلولر امیلایډ مجموعه ترسره کوي ناڅرګنده پاتې ده، ځکه چې د دې پروټین ډیر فشار پخپله دا پروسه نه کوي.د حجرو اضافي زیان اکثرا اړین دی، دا وړاندیز کوي چې د انټرا سیلولر αS امیلایډ اسمبلیونو د بیاجوړولو لپاره ځینې سیلولر ځایونه یا مایکرو چاپیریال اړین دي.یو سیلولر چاپیریال چې په ځانګړي ډول د راټولیدو خطر لري ممکن د پروټین کنډنسیټ 23 داخلي برخه وي.
په زړه پورې خبره دا ده چې αS او tau په انسانانو کې د پارکینسن ناروغۍ او نورو synucleinopathies 24,25 سره د ځانګړتیاو ناروغیو شاملولو کې ګډ ځای موندل شوي او تجربو د دوه پروټینونو 26,27 تر مینځ د همغږي رنځولوژیکي اړیکې راپور ورکړی چې د αS او مجموعې ترمینځ احتمالي اړیکې وړاندیز کوي. tau په عصبي ناروغیو کې.ناروغي.αS او tau په ویټرو او vivo 28,29 کې د یو بل د مجموعې تعامل او وده موندلي او د دې دوه پروټینونو څخه ترکیب شوي متفاوت مجموعې د synucleinopathies 30 ناروغانو په مغزو کې لیدل شوي.په هرصورت، د αS او tau ترمنځ د تعامل د مالیکول اساس او د هغې د یوځای کولو میکانیزم په اړه لږ څه پیژندل شوي.αS راپور شوي چې د αS د خورا منفي چارج شوي C-ټرمینل سیمې او د تاو مرکزي پرولین بډایه سیمې ترمینځ د الیکټراسټیک کشش له لارې له تاو سره تعامل کوي ، کوم چې په مثبت چارج شوي پاتې شونو کې هم بډایه کیږي.
په دې څیړنه کې، موږ وښیو چې αS کولی شي په حقیقت کې د تاو پروټین په شتون کې د الکترو سټیټیک پیچلي کنډسینشن له لارې په څاڅکو کې جلا شي، د نورو مثبت چارج شوي پولیپپټایډونو لکه پولی-L-lysine (pLK) سره د متقابل عمل برعکس.αS د څاڅکي شبکې لپاره د سکافول مالیکول په توګه کار کوي.موږ د الیکټروسټاټیک αS coacervates د بشپړتیا په پروسه کې د پام وړ توپیرونه پیژندلي، کوم چې د coacervate شبکه کې د پروټینونو د متقابل عمل توازن او ځواک کې توپیر سره تړاو لري.په زړه پورې خبره دا ده چې موږ د اوږدمهاله مایع coacervates کې د αS او tau amyloid پروټینونو ګډ مجموعه ولیدله او ځینې کلیدي فکتورونه مو په ګوته کړل چې د دې دوه پروټینونو ګډ مجموعه په ورته coacervates کې رامینځته کوي.دلته موږ دا پروسه په تفصیل سره بیانوو، کوم چې یو ممکن مالیکولر میکانیزم دی چې د ناروغۍ په ځانګړي شاملولو کې د دوه پروټینونو ټولیز کولو لاندې دی.
αS په بې طرفه pH (Fig. 1a) کې خورا لوړ anionic C-terminal tail لري، او موږ داسې انګیرله چې دا کولی شي د پولیکیشنیک بې نظمۍ لرونکي پولیپپټایډ مالیکولونو سره د الکتروسټټیک کمپلیکسونو د کنډیشن له لارې LLPS تیر کړي.موږ د پیل ماډل مالیکول په توګه د 100-residue poly-L-lysine (pLK) څخه کار اخلو ځکه چې په غیر جانبدار pH 32 کې د مثبت چارج شوي او ګډوډ پولیمیریک طبیعت له امله. لومړی، موږ تایید کړه چې pLK د حل NMR سپیکٹروسکوپي له لارې د αS د Ct ډومین سره اړیکه لري. (شکل 1b) د 13C/15N لیبل شوي αS په کارولو سره د αS:pLK د مولر تناسب زیاتوالي په شتون کې.د αS د Ct-domain سره د pLK تعامل ځان د کیمیاوي بدلون په ګډوډۍ او د پروټین په دې سیمه کې د لوړ شدت کمښت کې څرګندیږي.په زړه پورې خبره ده، کله چې موږ د pLK سره αS د αS غلظت نږدې سره مخلوط کړو.5–25 µM د پولیتیلین ګلایکول (5–15% PEG-8) په شتون کې (د عادي LLPS بفر: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) موږ سمدلاسه د پروټین جوړولو پراخه ساحې ته لاړو. .څاڅکي د فلوروسینس (WF) او روښانه فیلډ (BF) مایکروسکوپي (انځور 1c) په کارولو سره لیدل شوي.1-5 µm څاڅکي چې متمرکز αS لري (د 1 µM AlexaFluor488-لیبل شوي αS, AF488-αS اضافه شوي)، د دوی الیکټروسټاټیک ملکیتونه د 10٪ 1,6-hexanediol (1,6-HD) مقاومت او د هغې حساسیت څخه اخیستل کیدی شي. د NaCl غلظت زیاتوالی (انځور 1c).د αS/pLK الیکټروسټاټیک کمپلیکس coacervates د مایع په څیر طبیعت د دوی د وړتیا لخوا په ملی ثانیو کې د فیوز کولو وړتیا ښودل کیږي (انځور 1d).د turbidimetry په کارولو سره، موږ د دې شرایطو لاندې د څاڅکو جوړښت اندازه کړه، د اصلي متقابل عمل الیکټروسټیک طبیعت یې تایید کړ چې د هغې ثبات سره تړاو لري (انځور 1e)، او د LLPS پروسې په اړه د مختلف پولیمر تناسب اغیز ارزونه (انځور 1f).که څه هم د څاڅکو جوړښت د پولیمر تناسب په پراخه لړۍ کې لیدل کیږي، دا پروسه خورا مناسبه ده کله چې pLK د αS څخه ډیر وي.LLPs هم لیدل شوي چې د کیمیاوي مختلف بیځایه کولو اجنټ dextran-70 (70 kDa) په کارولو سره یا د مختلف نمونو فارمیټونو په کارولو سره لیدل شوي ، پشمول د شیشې سلایډ څاڅکي، د مختلفو موادو مایکروپلیټ څاګانې، ایپینډورف یا کوارټز کیپلیرونه.
په دې څیړنه کې کارول شوي WT-αS او ΔCt-αS ډولونو کې د مختلف پروټین سیمو سکیمیک نمایش.د امفیپیتیک N-ټرمینل ډومین، د هایدروفوبیک امیلایډ جوړونې (NAC) سیمه، او د منفي چارج شوي C-ټرمینل ډومین په ترتیب سره په نیلي، نارنجي او سور کې ښودل شوي.د WT-αS خالص چارج فی بقایا (NCPR) نقشه ښودل شوې.b د میکرومولیکولر کلمپونو په نشتوالي کې د αS/pLK تعامل NMR تحلیل.لکه څنګه چې د pLK غلظت زیاتیږي (αS:pLK د 1:0.5، 1:1.5، او 1:10 په ترتیب سره په رڼا شنه، شنه او تیاره شنه کې ښودل شوي).c Coacervate αS/pLK (مولر تناسب 1:10) په 25 µM (1 µM AF488-لیبل شوی αS یا Atto647N-لیبل شوی pLK د WF امیجنګ لپاره) په LLPS بفر (پورته) کې یا د 500 mMtobot NaCl سره ضمیمه یا وروسته پاتې) % 1,6-hexanediol (1,6-HD؛ لاندې ښي خوا ته).سکیل بار = 20 µm.d د αS/pLK د BF څاڅکي فیوژن نمایندګي مایکروسکوپیک عکسونه (د دانو تناسب 1:10) د 25 μM غلظت کې؛تیرونه په 200 ms کې دننه په نوي څاڅکي (نارنج تیر) کې د انفرادي څاڅکو (سور او ژیړ تیر) یوځای کیدل په ګوته کوي).سکیل بار = 20 µm.د روښنايي توزیع (په 350 nm کې) αS/pLK په LLPS بفر کې د 500 mM NaCl یا 10% 1,6-HD اضافه کولو دمخه او وروسته په 25 µM αS (N = 3 نمونې نقلونه، معنی او معیاري انحراف هم په ګوته شوي).f د BF عکس (پورته) او د αS/pLK مجموعه په 25 μM αS کې د αS/pLK مجموعه د رڼا توزیع تحلیل (په 350 nm کې، لاندې) د αS:pLK د مولر تناسب زیاتوالي سره (N = 3 نمونې نقلونه، معنی او معیاري انحراف هم په ګوته شوي).سکیل بار = 10 µm.په یو عکس کې د پیمانه بار په یوه پینل کې د ټولو عکسونو پیمانه په ګوته کوي.خام ډاټا د خام ډیټا فایلونو په بڼه چمتو کیږي.
د αS/pLK الیکټروسټاټیک پیچلي کنډنسیشن او د αS پخوانیو مشاهداتو پراساس د tau/RNA کنډنسیټ د پیرودونکي مالیکول په توګه د tau31 سره مستقیم تعامل له لارې ، موږ داسې انګیرله چې αS او tau د RNA په نشتوالي کې د محلول سره یوځای جلا کیدی شي. کنډیشند الکتروسټټیک کمپلیکسونو له لارې، او αS په αS/Tau coacervates کې د سکیفولډ پروټین دی (په 2e شکل کې د تاو چارج ویش وګورئ).موږ ولیدل چې کله 10 μM αS او 10 μM Tau441 (په ترتیب سره 1 μM AF488-αS او 1 μM Atto647N-Tau لري) په LLPS بفر کې یوځای سره مخلوط شوي، دوی په اسانۍ سره د پروټین مجموعه جوړه کړه چې دواړه پروټینونه لري، لکه څنګه چې د WF مایکروسکوپي لخوا لیدل کیږي.(انځور 2a).په څاڅکو کې د دوه پروټینونو یوځای کول د کنفوکال (CF) مایکروسکوپي (اضافي شکل 1a) لخوا تایید شوي.ورته چلند ولیدل شو کله چې dextran-70 د راټولولو اجنټ په توګه وکارول شو (اضافی شکل. 1c).د FITC-لیبل شوي PEG یا dextran په کارولو سره، موږ وموندله چې دواړه راټولونکي اجنټان په مساوي ډول په نمونو کې ویشل شوي، نه جلا کول او نه اتحادیه ښیي (اضافي شکل. 1d).بلکه، دا وړاندیز کوي چې په دې سیسټم کې دوی د میکرومولکولر کراوډینګ اغیزو له لارې د مرحلې جلا کولو ته وده ورکوي، ځکه چې PEG په غوره توګه مستحکم کراوډینګ ایجنټ دی، لکه څنګه چې په نورو LLP سیسټمونو کې لیدل کیږي 33,34.دا پروتین بډایه څاڅکي د NaCl (1 M) سره حساس وو مګر د 1,6-HD (10% v/v) سره حساس ندي، د دوی د الکترو سټیټیک ملکیتونو تصدیق کوي (اضافی شکل 2a، b).د دوی د مایعاتو چلند د BF مایکروسکوپي (انځور 2b) په کارولو سره د ملی ثانوي یوځای کیدو څاڅکي پیښو لیدو سره تایید شوی.
د αS/Tau441 د کنفوکل (CF) مایکروسکوپي انځورونه په LLPS بفر کې همغږي کوي (د هر پروټین 10 μM، د AF488 لیبل شوي αS او Atto647N لیبل شوي Tau441).b د αS/Tau441 څاڅکي فیوژن پیښو نمایشي توپیري مداخلې برعکس (DIC) انځورونه (د هر پروټین لپاره 10 μM).c د مرحلې ډیاګرام د Tau441 LLPS (0–15 µM) د روښنايي توزیع (په 350 nm کې) د 50 µM αS په نشتوالي (کیڼ اړخ) یا شتون (ښي) کې.ګرم رنګونه ډیر توزیع ښیي.d د αS غلظت زیاتوالي سره د αS/Tau441 LLPS نمونو روښانه توزیع (Tau441 په 5 µM، N = 2–3 نمونې تکرار لکه څنګه چې اشاره شوې).د ځینو تاو پروټین ډولونو سکیمیک استازیتوب او د پروټین مختلف سیمو چې پدې څیړنه کې کارول کیږي: منفي چارج شوی N-ټرمینل ډومین (سور)، پرولین بډایه سیمه (نیلي)، د مایکروټیوبیل پابند ډومین (MTBD، په نارنجي کې روښانه شوی)، او امیلایډ جوړونکي جوړه سرپل.د فیلامینټ سیمې (PHF) د MTBD (خړ) دننه موقعیت لري.د Tau441 د پاتې کیدو خالص چارج (NCPR) نقشه ښودل شوې.f د 1 µM AF488-لیبل شوي αS او Atto647N-لیبل شوي ΔNt- کارول، د ΔNt-Tau په شتون کې د 1 µM AF488 لیبل شوي αS یا ΔCt-αS په کارولو سره (پورته، 10 µM فی پروټین) یا K18 (په هر پروټین، 10 µM bottom) ) ) ) د WF مایکروګرافونه په LLPS یا K18 بفر کې کنډ شوي.په یو عکس کې د پیمانه بارونه په یوه پینل کې د ټولو عکسونو پیمانه څرګندوي (20 µm د پینل a, b او f لپاره).د C او d پینلونو لپاره خام ډیټا د خام ډیټا فایلونو په توګه چمتو شوي.
د LLPS په دې پروسه کې د αS رول ازموینې لپاره، موږ لومړی د NaCl (انځور 2c) زیاتیدونکي غلظت په کارولو سره د نیفیلومیټري په واسطه د څاڅکي ثبات باندې د αS اغیزې پلټنه وکړه.په نمونو کې چې αS لري د مالګې غلظت لوړ وي، د رڼا توزیع کولو ارزښتونه (په 350 nm کې) لوړ وي، کوم چې پدې LLPS سیسټم کې د αS ثبات رول په ګوته کوي.ورته اغیزه د αS غلظت (او له همدې امله د αS:Tau441 تناسب) شاوخوا ته په زیاتولو سره لیدل کیدی شي.د تاو غلظت (5 µM) په پرتله 10 چنده زیاتوالی (انځور 2d).د دې لپاره چې وښیې چې αS په coacervates کې یو سکیفولډ پروټین دی، موږ پریکړه وکړه چې د LLPS - ګډوډ شوي Tau mutant چلند وڅیړو، کوم چې د منفي چارج شوي N-ټرمینل سیمه نلري (پاشیشونه 1-150، انځور 2e وګورئ) چې ΔNt-Tau نومیږي.د WF مایکروسکوپي او نیفیلومیټري تایید کړه چې ΔNt-Tau پخپله LLPS (انځور 2f او ضمیمه انځور. 2d) نه دی اخیستی، لکه څنګه چې مخکې راپور شوی 14. په هرصورت، کله چې αS د دې تخریب شوي تاو ډوله تحلیل حلونو کې اضافه شو، د LLPS پروسه په بشپړه توګه وه. د څاڅکو کثافت سره د ورته شرایطو او پروټین غلظت لاندې د Tau او αS بشپړ اندازې محلولونو د څاڅکي کثافت سره نږدې ساتل کیږي.دا پروسه د ټیټ میکرومولکولر ډیریدو شرایطو کې هم لیدل کیدی شي (اضافی شکل. 2c).د C-ټرمینل αS سیمې رول، مګر د هغې ټول اوږدوالی نه، د LLPS پروسې کې د څاڅکي جوړښت د مخنیوي لخوا ښودل شوی و چې د C-ټرمینل ترمینل αS ډوله د پاتې شونو 104-140 (انځر 1a) نشتوالی په کارولو سره د (ΔCt-) αS) پروټین (انځور 2f او اضافي شکل. 2d).د αS او ΔNt-Tau ټولیز کول د کنفوکال فلوروسینس مایکروسکوپي لخوا تایید شوي (اضافي شکل. 1b).
د Tau441 او αS تر منځ د LLPS میکانیزم د لا ازموینې لپاره، د Tau اضافي ډول کارول شوی و، د بیلګې په توګه د مایکروټیوبیل پابند ډومین (MTBD) کې جوړه شوې هیلیکل فیلامینټ کور (PHF) ټوټه، چې که دا څلور ځانګړتیاوې تکرار ډومینونه ولري، په عام ډول هم پیژندل کیږي. د K18 ټوټې په توګه (د انځور 2e وګورئ).په دې وروستیو کې راپور ورکړل شوی چې αS په ترجیحي توګه د تاو پروټین سره تړلی دی چې په پرولین بډایه ډومین کې موقعیت لري په داسې ترتیب کې چې د مایکروټیوبیل پابند ډومین څخه مخکې وي.په هرصورت، د PHF سیمه په مثبت ډول چارج شوي پاتې شونو کې هم بډایه ده (شکل 2e وګورئ)، په ځانګړې توګه لیسین (15٪ پاتې شونو)، کوم چې موږ یې د ازموینې لپاره هڅول چې ایا دا سیمه د αS/Tau کمپلیکس په کنډیشن کې هم مرسته کوي.موږ ولیدل چې یوازې K18 نشي کولی د ازمول شوي شرایطو لاندې تر 100 μM پورې غلظت کې LLPS رامینځته کړي (د 15٪ PEG یا 20٪ dextran سره LLPS بفر) (شکل 2f).په هرصورت، کله چې موږ د 50 µM K18 ته 50 µM αS اضافه کړل، د پروټین څاڅکو چټک جوړښت چې K18 او αS لري د نیفیلومیټري (اضافي شکل 2d) او WF مایکروسکوپي (انځور 2f) لخوا مشاهده شو.لکه څنګه چې تمه کیده، ΔCt-αS د K18 (Fig. 2f) د LLPS چلند بحالولو توان نلري.موږ یادونه کوو چې αS/K18 راټولول د αS/ΔNt-Tau یا αS/Tau441 په پرتله د LLPS هڅولو لپاره یو څه لوړ پروټین غلظت ته اړتیا لري، نور شیان مساوي دي.دا د مایکروټیوبیل پابند ډومین په پرتله د پرولین بډایه تاو ډومین سره د αS C-ټرمینل سیمې قوي تعامل سره مطابقت لري، لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي 31.
د دې په پام کې نیولو سره چې ΔNt-Tau نشي کولی د αS په نشتوالي کې LLPS ترسره کړي، موږ دا Tau ډول د αS/Tau LLPS ځانګړتیا لپاره د ماډل په توګه غوره کړی چې د LLPS سیسټمونو کې د بشپړ اوږدوالی Tau (isotype، Tau441/Tau441) سره د هغې سادگي په پام کې نیولو سره.د پیچلي (heterotypic، αS/Tau441) د راټولولو پروسو سره.موږ په αS/Tau او αS/ΔNt-Tau سیسټمونو کې د سنټرفیوګیشن او منتشر پړاو SDS-PAGE تحلیل (وګورئ 2e) کې د αS مجموعه (د کنډس شوي مرحلې پروټین د یوې برخې په توګه fαS,c) پرتله کړه، ډیر ورته ارزښتونه وموندل. په ورته غلظت کې د ټولو پروټینونو لپاره.په ځانګړې توګه، موږ په ترتیب سره د αS/Tau او αS/ΔNt-Tau لپاره fαS,c 84 ± 2% او 79 ± 7% ترلاسه کړل، دا وړاندیز کوي چې د αS او tau تر منځ هیټروټایپیک تعامل د تاو مالیکولونو تر مینځ د تعامل څخه غوره دی.ترمنځ.
د مختلفو پولیکیشنونو سره تعامل او په αS کایناتیکونو کې د کنډنسیشن پروسې اغیز لومړی د فوتو بلیچنګ (FRAP) میتود وروسته د فلوروسینس ریکوری لخوا مطالعه شو.موږ αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau او αS/pLK coacervates ازموینه وکړه (100 μM αS د 2 μM αS AF488-αS او 100 μM Tau441 یا ΔNt-Tau یا 1 mM pLK سره ضمیمه شوي).معلومات د نمونې اجزاو مخلوط کولو وروسته په لومړیو 30 دقیقو کې ترلاسه شوي.د نمایشي FRAP انځورونو څخه (انځور. 3a، αS/Tau441 کنډنسیشن) او د دوی اړوند وخت کورس منحني (انځور. 3b، اضافي شکل. 3)، دا لیدل کیدی شي چې د αS کایناتیک د Tau441 coacervates سره ډیر ورته دی.او ΔNt-Tau، کوم چې د pLK سره ډیر چټک دی.د αS لپاره د FRAP له مخې د coacervate دننه د αS لپاره محاسبه شوي ډیفیوژن کوفیشینټونه (لکه څنګه چې د کانګ او ال 35 لخوا تشریح شوي) د αS/Tau4 لپاره D = 0.013 ± 0.009 µm2/s او D = 0.026 ± 0.008 µm2/s د αS/Tau4 لپاره. د αS/ سیسټم.pLK، Tau، او D = 0.18 ± 0.04 µm2/s، په ترتیب سره (3c انځور).په هرصورت، په منحل شوي مرحله کې د ډیفیوژن کوفیسینټ αS د ټولو کنډس شوي مرحلو په پرتله د شدت څو امرونه لوړ دي، لکه څنګه چې د فلوروسینس ارتباط سپیکٹروسکوپي (FCS، ضمیمه انځور 3 وګورئ) د ورته شرایطو لاندې (LLPS بفر) مګر د پولیکیشن په نشتوالي کې. (D = 8 ± 4 µm2/s).له همدې امله، د αS ژباړې کایناتیک د توزیع شوي پړاو کې د پروټینونو په پرتله په coacervates کې د پام وړ کم شوی د مالیکولر راټولولو اغیزو له امله، که څه هم ټول coacervates د جوړیدو وروسته په لومړي نیم ساعت کې د مایع په څیر ملکیتونه ساتي، د تاو مرحله برعکس.په pLK کنډنسیټ کې ګړندی کایناتیک.
a–c د αS ډینامیکونو FRAP تحلیل (2% AF488-لیبل شوی αS) په الکتروسټټیک کوسرویټس کې.په درې اړخیزه توګه د αS/Tau441 FRAP اسیسونو نمایندګي انځورونه په (a) کې ښودل شوي، چیرته چې سور حلقې رنګ شوي ساحې په ګوته کوي.د پیمانه بار 5 µm دی.b اوسط FRAP منحنی او (c) د 5-6 (N) لپاره د 100 µM αS او د Tau441 (سور) یا ΔNt-Tau (نیلي) یا pLK (شین) مساوي غلظت په کارولو سره د دریو تجربو څخه د 5-6 (N) مختلف څاڅکو لپاره محاسبه شوي ډیفیوژن کوفیسینټس (D) د LLPS غلظت لس ځله.د FRAP وکر معیاري انحراف په سیوري رنګ کې ښودل شوی.د پرتله کولو لپاره، په منحل مرحله کې د تحلیل کوفیشین αS د فلوروسینس ارتباط سپیکٹروسکوپي (FCS) په کارولو سره په درې اړخیزه توګه ټاکل شوی (د نورو معلوماتو لپاره ضمیمه 3 شکل او میتودونه وګورئ).d په LLPS بفر کې د 100 μM TEMPOL-122-αS دوامداره X-band EPR سپیکٹرا پرته له کوم پولیکیشن (تور) یا د 100 μM Tau441 (سور) یا ΔNt-Tau (نیلي) یا 1 mM pLK (شین) شتون کې.انسیټ د قوي ساحې لینونو پراخه لید ښیې چیرې چې خورا ډراماتیک بدلونونه پیښیږي.د 50 μM TEMPOL-122-αS پابند منحني د LLPS په نشتوالي کې د مختلف پولیکیشنونو سره (نه PEG).د نورمال شوي EPR سپیکٹرم د بانډ II (IIII/III) په پرتله د بانډ III کم شوی طول د Tau441 (سرخ) ، ΔNt-Tau (نیلي) او pLK (شنه) د مولر تناسب زیاتوالي لپاره ښودل شوي.رنګ شوي کرښې په هر وکر کې د n ورته او خپلواک پابند سایټونو سره د ناڅاپه پابند ماډل په کارولو سره ډیټا ته مناسب ښیې.خام ډاټا د خام ډیټا فایلونو په بڼه چمتو شوي.
د بشپړولو په توګه، موږ د مستقیم سپن لیبلینګ (SDSL) او دوامداره الکترون پارامیګنیټیک ریزونانس (CW-EPR) په کارولو سره په مختلفو کوسرویټونو کې د αS متحرکات تحقیق کړل.دا طریقه د 36,37,38 ریښتیني پاتې کیدو حل سره د IDP د انعطاف او متحرکاتو راپور ورکولو کې خورا ګټور ثابت شوی.د دې لپاره، موږ په واحد Cys mutants کې د سیسټین پاتې شونه جوړ کړل او د 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) سپن تحقیقاتو څخه کار واخیست.د میلیمایډ مشتق دوی لیبل کوي.په ځانګړې توګه، موږ په 122 یا 24 αS (TEMPOL-122-αS او TEMPOL-24-αS) کې د TEMPOL تحقیقات داخل کړل.په لومړي حالت کې، موږ د پروټین C-ټرمینل سیمه په نښه کوو، کوم چې د پولیکیشن سره په تعامل کې ښکیل دي.پرځای یې، موقعیت 24 کولی شي موږ ته په کنډنسیټ کې د پروټینونو ټولیز متحرکاتو په اړه معلومات راکړي.په دواړو حالتونو کې، د منتشر پړاو پروټینونو لپاره ترلاسه شوي EPR سیګنالونه په ګړندۍ حرکت کې د نایټروکسایډ رادیکالونو سره مطابقت لري.د Tau یا pLK (100 μM TEMPOL-αS، Tau441 یا ΔNt-Tau د 1:1 په تناسب یا pLK د 1:10 په تناسب) کې د مرحلې جلا کیدو وروسته، د نسبي لوړ شدت زیاتوالی په کې لیدل شوی. د αS EPR طیف.د ضایع کولو کرښه پراخه شوې، په څاڅکو کې د αS د بیا تنظیم کولو کایناتیک کموالی په ګوته کوي د پروټین په پرتله په نازک پړاو کې (انځور 3d، اضافي شکل. 4a).دا بدلونونه په 122 موقعیت کې ډیر څرګند دي. پداسې حال کې چې په 24 موقعیت کې د pLK شتون د تحقیقاتو کایناتیک اغیزه نده کړې، په 122 موقعیت کې د طیفې کرښې شکل د پام وړ بدل شوی (اضافی شکل 4a).کله چې موږ د اسوټروپیک ماډل (اضافي شکل 5a) په کارولو سره د دوه αS/پولیکیشن سیسټمونو 122 موقعیت کې سپیکٹرا ماډل کولو هڅه وکړه چې معمولا د سپن لیبل IDP38,39 متحرکاتو تشریح کولو لپاره کارول کیږي، موږ نشو کولی د تجربوي سپیکٹرا بیا رغونه وکړو..د 24 سپنونو برعکس د موقعیت سپیکٹرل سمولیشن (اضافی شکل. 5a).دا وړاندیز کوي چې د پولیکیشنونو په شتون کې د αS د C-ټرمینل سیمې د سپن تشکیلاتو ځای کې ترجیحي موقعیتونه شتون لري.کله چې د تجربوي EPR شرایطو لاندې په کنډ شوي مرحله کې د αS برخې ته پام وکړئ (84 ± 2٪، 79 ± 7٪، او 47 ± 4٪ د αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau، او αS/pLK لپاره، په ترتیب سره - ضمیمه وګورئ انځور 2e د ډیټا تحلیل c)، دا لیدل کیدی شي چې د EPR میتود لخوا کشف شوي پراخوالی په عمده توګه د αS د C-ټرمینل سیمې متقابل عمل منعکس کوي د مختلف پولیکیشنونو سره په کنډنډ مرحله کې (اصلي بدلون کله چې د TEMPOL-122 کارول کیږي. αS)، او نه د پروټین کنډیشن.د مایکروویسکوسیت زیاتوالی په تحقیقاتو کې لیدل کیږي.لکه څنګه چې تمه کیده، د LLPS پرته په نورو شرایطو کې د پروټین EPR سپیکٹرم په بشپړه توګه بیرته راګرځیدلی و کله چې 1 M NaCl مخلوط ته اضافه شو (اضافی شکل. 4b).په ټولیز ډول، زموږ معلومات وړاندیز کوي چې د CW-EPR لخوا کشف شوي بدلونونه په عمده توګه د αS د C-ټرمینل سیمې تعامل منعکس کوي د مختلفو پولیکیشنونو سره په کنډس شوي مرحله کې، او دا تعامل د تاو په پرتله د pLK سره پیاوړی ښکاري.
په coacervate کې د پروټینونو په اړه د نورو جوړښتي معلوماتو ترلاسه کولو لپاره، موږ پریکړه وکړه چې د LLPS سیسټم په حل کې د NMR په کارولو سره مطالعه کړو.په هرصورت، موږ کولی شو یوازې د منتشر پړاو کې پاتې αS برخه کشف کړو، کوم چې کیدای شي د کوسرویټ دننه د پروټین ډینامیکونو کمولو او د NMR تحلیل کې د حل په پای کې د کثافاتو مرحلې له امله وي.کله چې موږ د NMR (اضافي شکل 5c، d) په کارولو سره د LLPS نمونې په منحل مرحله کې د پاتې شوي پروټین جوړښت او متحرکات تحلیل کړل، موږ ولیدل چې پروتین د pLK او ΔNt-Tau په شتون کې نږدې ورته چلند کوي. کوم چې د پروټین شاته د ثانوي جوړښت او متحرکاتو کې وو، د ثانوي کیمیاوي بدلون او R1ρ آرامۍ تجربو لخوا څرګند شوي.د NMR ډاټا ښیي چې د C-Terminus αS د جوړښتي انعطاف د پام وړ زیان سره مخ کیږي پداسې حال کې چې خپل ګډوډ طبیعت ساتي، لکه د پاتې پروټین سلسلې په څیر، د پولیکیشن سره د تعامل له امله.
له هغه وخته چې د CW-EPR سیګنال پراخوالی د TEMPOL-122-αS کنډ شوي پړاو کې لیدل شوی د پولیکیشن سره د پروټین تعامل منعکس کوي، موږ د LLPS په نشتوالي کې د مختلفو پولیکیشنونو سره د αS پابند تړاو ارزولو لپاره د EPR ټیکټریشن ترسره کړ (هیڅ جمع نه دی. بفر LLPS)، وړاندیز کوي چې تعاملات په کم او متمرکز پړاوونو کې یو شان دي (کوم چې زموږ د معلوماتو لخوا تایید شوي، ضمیمه انځور. 4a او ضمیمه انځور. 6).موخه دا وه چې وګورو چې آیا ټول coacervats، د دوی د عام مایع په څیر ملکیتونو سره سره، په مالیکولر کچه کې کوم بنسټیز توپیر چلند څرګندوي.لکه څنګه چې تمه کیده، د EPR سپیکٹرم د پولیکیشن غلظت د زیاتوالي سره پراخ شوی، د مالیکول انعطاف کمښت منعکس کوي د ټولو متقابل شریکانو مالیکولر تعاملاتو له امله چې تقریبا تر سنتریت پورې اړه لري (انځور 3e، ضمیمه شکل. 6).pLK د ΔNt-Tau او Tau441 په پرتله په ټیټ دالر تناسب (polycation:αS) کې دا سنتریت ترلاسه کړ.په حقیقت کې، د اټکل شوي پابند ماډل سره د معلوماتو پرتله کول د n ورته او خپلواک پابند سایټونو فرض کول وښودله چې د pLK (~ 5 μM) څرګند انحلال ثابت د Tau441 یا ΔNt-Tau (~ 50 μM) څخه د ټیټ شدت ترتیب دی. ).µM).که څه هم دا یو دقیق اټکل دی، دا وړاندیز کوي چې αS د دوامداره مثبت چارج سیمو سره د ساده پولیکیشنونو لپاره لوړ تړاو لري.د αS او مختلف پولیکیشنونو تر مینځ په تړاو کې دې توپیر ته په پام سره، موږ داسې انګیرله چې د دوی مایع ملکیت ممکن د وخت په تیریدو سره توپیر ولري او پدې توګه د مختلف LSPT پروسو سره مخ کیږي.
د پروټین coacervate او د پروټین امیلایډ طبیعت کې د ډیری ګڼې ګوڼې چاپیریال ته په پام سره، موږ د وخت په تیریدو سره د coacervate چلند لیدلی ترڅو د LSPT احتمالي پروسې کشف کړي.د BF او CF مایکروسکوپي (شکل 4) په کارولو سره، موږ ولیدل چې αS/Tau441 په لویه کچه په محلول کې سره یوځای کیږي، لوی څاڅکي جوړوي چې د څاه / سلایډ په پای کې سطح سره تماس نیسي او د بشپړ څاڅکو په توګه لوند کوي، لکه څنګه چې تمه کیده (اضافي شکل 7d);موږ دې لاندې جوړ شوي جوړښتونو ته "پروټین رافټ" وایو.دا جوړښتونه مایع پاتې شول ځکه چې دوی د فیوز کولو وړتیا ساتلې وه (اضافی شکل. 7b) او د LLPS پیل کیدو وروسته د څو ساعتونو لپاره لیدل کیدی شي (انځور 4 او اضافي شکل. 7c).موږ ولیدل چې د لوند کولو پروسه د هایدروفوبیک موادو پر ځای د هایدروفوبیک موادو په سطحه غوره ده (اضافي شکل. 7a)، لکه څنګه چې تمه کیده د غیر متوازن چارجونو سره د الیکټروسټاټیک کوسرویټس او په دې توګه د لوړ الیکټروسټاټیک سطح پوټینشنونه.د پام وړ، αS/ΔNt-Tau یووالی او رافټینګ د پام وړ کم شوی، پداسې حال کې چې αS/pLK کنډنسیټس د پام وړ کم شوی (4 شکل).د لنډ انکیوبیشن وخت په جریان کې، د αS/pLK څاڅکي د هایدروفیلیک سطح سره یوځای کولو او لندبل کولو توان درلود، مګر دا پروسه په چټکۍ سره ودرول شوه او د 5 ساعتونو انکیوبیشن وروسته، یوازې محدود یووالی پیښې او هیڅ لوند ندی لیدل شوی.- د جیل ډریپ لیږد.
نمایندګي BF (ګریسکل پینلونه) او CF (ښي تختې، په شنه کې AF488 لیبل شوی αS) د coacervate نمونې چې د 100 µM αS (1٪ فلوروسینټ لیبل) لري په LLPS بفر کې د 100 µM Tau415 picstop images (micro 488) په شتون کې. - تاو (مرکز) یا 1 mM pLK (لاندې) په مختلف انکیوبیشن وختونو او فوکل لوړوالی (z، د پلیټ له لاندې څخه فاصله).تجربې د ورته پایلو سره د یو بل څخه په خپلواکه توګه 4-6 ځله تکرار شوي.αS/Tau441 coacervates د 24 ساعتونو وروسته لندبل کیږي، د عکس څخه لوی رافټونه جوړوي.د ټولو عکسونو لپاره پیمانه بار 20 µm دی.
بیا مو وپوښتل چې ایا د مایع په څیر لوی پروټین حوضونه چې په αS/Tau441 LLPS کې رامینځته شوي د هر هغه پروټینونو امیلایډ مجموعې لامل کیږي چې مطالعه شوي.موږ د وخت په تیریدو سره د WF مایکروسکوپي سره د پورته شرایطو لاندې د αS/Tau441 څاڅکو پخیدل تعقیب کړل، مګر د 1 μM AF488 لیبل شوي αS او Atto647N-لیبل شوي Tau441 (انځور 5a) کارول.لکه څنګه چې تمه کیده، موږ د بشپړتیا په بهیر کې د پروټین بشپړ ځایی کول ولیدل.په زړه پورې، له ca.د 5 ساعتونو وروسته، د رافټ دننه ډیر شدید غیر سرکولر جوړښتونه لیدل شوي، چې موږ یې "پوائنټونه" بولو، ځینې یې د αS سره یوځای شوي، او ځینې یې په Tau441 کې بډایه شوي (5a، سپینې تیرونه).دا ځایونه تل د αS/ΔNt-Tau لپاره د αS/ΔNt-Tau په پرتله په پراخه کچه په رافټونو کې لیدل شوي.د pLK او Tau سیسټمونو په څاڅکو کې کوم ځانګړي ځایونه شتون نلري چې د فیوژن / لوند کولو لپاره وړ ندي.د ازموینې لپاره چې ایا دا داغونه چې αS او Tau441 لري د امیلایډ په څیر مجموعې دي، موږ د CF مایکروسکوپي په کارولو سره ورته تجربه ترسره کړه چې په کې Tau441 د Atto647N سره لیبل شوی و او 12.5 μM امیلایډ ځانګړي thioflavin-T (ThT) له پیل څخه اضافه شوي.رنګکه څه هم د αS/Tau441 څاڅکو یا رافټونو ThT داغونه حتی د 24 ساعتونو انکیوبیشن وروسته هم نه دي لیدل شوي (انځور 5b، پورتنۍ قطار - د پروټین رافټونو په اړه پاتې څاڅکي)، د ThT مثبت جوړښت چې Atto647N-Tau441 لري د رافټونو دننه خورا ضعیف و.دا د مخکینیو بیان شویو ځایونو اندازه، شکل، او موقعیت ته نقل کوي (انځور 5b، منځني او لاندې قطارونه)، وړاندیز کوي چې دا داغونه ممکن د عمر لرونکي مایع coacervates کې رامینځته شوي امیلایډ په څیر مجموعو سره مطابقت ولري.
WF 25 μM αS په مختلفو انکیوبیشن وختونو او د فوکل لوړوالی (z، د بې حده ښکته څخه فاصله) د 25 μM Tau441 (1 μM AF488-لیبل شوي αS او Atto647N-لیبل شوي Tau441) په شتون کې د مایکروسکوپ پلیټ په یوه څاه کې د LLPS buffer سره) .شپږ تجربې په خپلواکه توګه د ورته پایلو سره تکرار شوي.د 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labeled Tau441) او 12.5 μM thioflavin-T (ThT) په شتون کې د 25 μM αS CF مایکروسکوپي عکس.د وزن لرونکي پروټین څاڅکي او زیرمه شوي پروټین رافټونه او ځایونه په ترتیب سره په پورتنۍ او مینځنۍ قطار کې ښودل شوي.لاندې قطار د 3 خپلواک نقلونو څخه د رافټ او څاڅکو عکسونه ښیې.سپین تیر په دواړو تختو کې د ThT مثبت نقطې په ګوته کوي.د ټولو عکسونو لپاره پیمانه بار 20 µm دی.
د مایع څخه جامد ته د لیږد په جریان کې د coacervate پروټین شبکې کې د بدلونونو په اړه د لا زیاتو توضیحاتو معاینه کولو لپاره، موږ د فلوروسینس ژوند وخت امیجنگ (FLIM) او د Förster ریزونانس انرژی لیږد مایکروسکوپي (FRET) (شکل 6 او اضافي شکلونه 8 او 9) کارولي.موږ داسې انګیرنه وکړه چې د پرت سره د پرت په ترکیب کې د یو ډیر کنډ شوي یا حتی جامد په څیر راټول شوي پروټین جوړښت کې د پروټین او فلوروسینټ تحقیقاتو تر مینځ نږدې تماس لامل کیږي، په بالقوه توګه د یوې لنډې څیړنې په ژوند کې څرګند شوي د شنډولو اغیز تولیدوي (τ) لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي 40.,41,42برسېره پردې، د دوه ګوني لیبل شوي نمونو لپاره (AF488 او Atto647N په ترتیب سره د FRET ډونر او منلو وړ رنګونو په توګه)، په τ کې دا کمښت هم د LSPT په جریان کې د FRET(E) موثریت زیاتوالي سره د coacervate condensation سره مل کیدی شي.موږ په LLPS αS/Tau441 او αS/ΔNt-Tau نمونو کې د وخت په تیریدو سره د رافټ او ځای جوړونې څارنه وکړه (په LLPS بفر کې د هر پروټین 25 µM 1 µM AF488 لیبل شوي αS او/یا Atto647N لیبل شوي Tau441 یا ΔNt-Tau).موږ په دې کې یو عمومي تمایل ولید چې د AF488 (τ488) او Atto647N (τ647N) تحقیقاتو د فلوروسینس ژوند موده یو څه کمه شوې لکه څنګه چې کوسرویټس پاخه شوي (انځور 6 او اضافي شکل. 8c).په زړه پورې خبره دا ده چې دا بدلون په رافټونو کې د نقطو لپاره د پام وړ وده کړې وه (انځور 6c)، دا په ګوته کوي چې نور پروټین کنډیشن په نقطو کې پیښ شوي.د دې په ملاتړ، د αS/ΔNt-Tau څاڅکو لپاره چې د 24 ساعتونو لپاره عمر لري د فلوروسینس په ژوند کې کوم د پام وړ بدلون ندی لیدل شوی (اضافی شکل. 8d)، وړاندیز کوي چې د څاڅکي جیلیشن یوه پروسه ده چې د سپیټ کولو څخه توپیر لري او دا د پام وړ مالیکولر بیا تنظیم کولو سره نه وي. د coacervates دننه.دا باید په پام کې ونیول شي چې نقطې په αS کې مختلف اندازې او متغیر محتويات لري، په ځانګړې توګه د αS/Tau441 سیسټم لپاره (اضافی شکل. 8e).د ځای د فلوروسینس ژوند کې کمښت د شدت د زیاتوالي سره مل و، په ځانګړې توګه د Atto647N لیبل شوي Tau441 (اضافي شکل. 8a)، او د αS/Tau441 او αS/ΔNt-Tau سیسټمونو لپاره لوړ FRET موثریتونه، په پنځو ساعتونو کې نور کنډیشن په ګوته کوي. د محرک کولو وروسته، د جامد بریښنا دننه پروټینونه کنډډ شوي.د αS/ΔNt-Tau په پرتله، موږ په αS/Tau441 ځایونو کې ټیټ τ647N او یو څه لوړ τ488 ارزښتونه ولیدل، د ټیټ او ډیر غیر همجنسي FRET ارزښتونو سره.احتمالا، دا ممکن د دې حقیقت سره تړاو ولري چې په αS/Tau441 سیسټم کې، په مجموع کې د لیدل شوي او تمه شوي αS کثرت ډیر متضاد دی، ډیری وختونه د Tau په پرتله فرعي سټوچیومیټریک دی، ځکه چې Tau441 پخپله هم د LLPS او مجموعې څخه تیریږي (اضافی شکل 8e) .په هرصورت، د څاڅکو د یووالي درجې، د رافټ جوړښت، او په مهمه توګه، د مایع په څیر coacervates کې د پروټین راټولول خورا اعظمي دي کله چې دواړه Tau441 او αS شتون ولري.
د ژوندانه فلوروسینس مایکروسکوپي (FLIM) د αS/Tau441 او αS/ΔNt-Tau انځورونه د هر پروټین په 25 μM کې (1 μM AF488-لیبل شوی αS او 1 μM Atto647N-لیبل شوی Tau441 یا ΔNt-Tau په LLPS buffer) کې.کالمونه د LLPS نمونو نمایندګي انځورونه په مختلفو وختونو کې ښیي (30 دقیقې، 5 h او 24 h).سور چوکاټ هغه سیمه ښیي چې αS/Tau441 ځایونه لري.د ژوند موده د رنګ بارونو په توګه ښودل شوي.سکیل بار = د ټولو عکسونو لپاره 20 µm.b د ټاکل شوې ساحې FLIM عکس زوم شوی ، په پینل a کې په سور بکس کې ښودل شوی.د ژوند سلسلې د ورته رنګ پیمانې په کارولو سره ښودل شوي لکه څنګه چې په پینل a کې.سکیل بار = 5 µm.c هسټوګرامونه چې د AF488 (αS سره نښلول شوي) یا Atto647N (Tau سره نښلول شوي) د مختلف پروټین ډولونو (droplets-D-، raft-R- او speckle-P) ښیي چې د αS- لپاره ثبت شوي FLIM عکسونو کې پیژندل شوي د Tau441 او د ژوند مهال ویش مهال ویش. αS/ΔNt-Tau coacervate نمونې (N = 17-32 ROI د D لپاره، 29-44 ROI د R لپاره، او د پوائنټونو لپاره 21-51 ROI).منځنۍ او منځنۍ ارزښتونه په ترتیب سره د بکسونو دننه د ژیړ مربع او تور لیکو په توګه ښودل شوي.د بکس ښکته او پورتنۍ حدود په ترتیب سره د لومړي او دریم ربع استازیتوب کوي، او د 1.5-fold interquartile رینج (IQR) دننه لږترلږه او اعظمي ارزښتونه د ویسکرز په توګه ښودل شوي.بهرنیان د تور الماس په توګه ښودل شوي.د توزیع د جوړو تر مینځ احصایوي اهمیت د دوه نمونو ټ-ټیسټ په کارولو سره ټاکل شوی و، د غیر مساوي توپیرونو په نظر کې نیولو سره.د دوه مخی T-Test p-values ​​د هرې جوړې پرتله شوي ډیټا لپاره د ستورو سره ښودل شوي (* p-value> 0.01, ** p-value> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** p-value > 0.00001)، ns بې پروايي په ګوته کوي (p-value > 0.05).دقیق p ارزښتونه په ضمیمه جدول 1 کې ورکړل شوي ، او اصلي ډاټا د خام ډیټا فایلونو په توګه وړاندې کیږي.
د امیلایډ په څیر د داغونو / مجموعو د طبیعت نور څرګندولو لپاره، موږ د 24 ساعتونو لپاره د (1 M) NaCl لوړ غلظت سره د غیر داغ شوي coacervate نمونې درملنه وکړه، چې پایله یې د پروټین کوسرویټس څخه مجموعه جلا شوه.کله چې جلا شوي مجموعې (د بیلګې په توګه، د مجموعو منحل شوي محلول) د اټومي ځواک مایکروسکوپي (AFM) په کارولو سره مشاهده شول، موږ په عمده توګه د 15 nm منظم لوړوالی سره کروی مورفولوژي مشاهده کړه، کوم چې د لوړ مالګې غلظت شرایطو سره تړاو لري، ورته ورته. په سطح باندې د قوي هایدروفوبیک اغیزې له امله د عادي امیلایډ فایبریلونو چلند (یادونه وکړئ چې فایبریلونه معمولا ~ 10 nm لوړوالی لري) (اضافی شکل 10a).په زړه پورې خبره، کله چې جلا شوي مجموعې د ThT سره په معیاري ThT فلوروسینس ارزونه کې ځای په ځای شوي، موږ د ThT فلوروسینس کوانټم حاصلاتو کې ډراماتیک زیاتوالی ولید، د هغه په ​​پرتله چې لیدل شوي کله چې رنګ د عادي αS امیلایډ فایبریلونو (اضافي F10b)، وړاندیز کوي. coacervate مجموعه د امیلایډ په څیر جوړښتونه لري..په حقیقت کې، مجموعه د مالګې لوړ غلظت ته د زغم وړ وو مګر د 4 M guanidine کلورایډ (GdnHCl) سره حساس وو، لکه د عادي امیلایډ فایبریلونو (اضافي شکل. 10c).
بیا، موږ د واحد مالیکول فلوروسینس په کارولو سره د مجموعو ترکیب تحلیل کړ، د ځانګړي فلوروسینس ارتباط / کراس ارتباط سپیکٹروسکوپي (FCS/FCCS)، او د دوه رنګونو اتفاق کشف (TCCD) تحلیل تحلیل.د دې لپاره، موږ د 100 μl LLPS نمونو کې د 24 ساعتونو انکیوبیشن وروسته جوړ شوي مجموعې جلا کړې چې پکې αS او Tau441 (دواړه 25 μM) د 1 μM AF488-لیبل شوي αS او 1 μM Atto647N-لیبل شوي Tau441 سره یوځای شوي.د ورته PEG-free بفر او 1 M NaCl (هغه بفر چې د coacervate څخه د مجموعو د جلا کولو لپاره کارول کیږي) په کارولو سره په پایله کې منتشر شوي مجموعي محلول په مونومولیکولر حالت کې ضعیف کړئ ترڅو د LLPS او پروټین ترمینځ د هر ډول احتمالي الیکټروسټاټیک تعامل مخه ونیسي.د یو واحد مالیکول د وخت تیریدو یوه بیلګه په 7a شکل کې لیدل کیدی شي.د FCCS/FCS تحلیل (کراس ارتباط، CC او اتوماتیک تړاو، AC) وښودله چې αS او tau لرونکی مجموعه په نمونو کې په پراخه کچه شتون لري (د CC وکر په شکل 7b، کیڼ تخته کې وګورئ)، او د پاتې شونو مونومیریک پروټین ډیر مقدار په توګه راڅرګند شو. د کمولو پروسې پایله (د AC منحنی شکل په 7b شکل کې، کیڼ تخته وګورئ).د کنټرول تجربې د ورته حل شرایطو لاندې ترسره شوي د نمونو په کارولو سره چې یوازې مونومیریک پروټینونه پکې شامل دي هیڅ CC منحني ندي ښودل شوي ، او د AC منحني د یو اجزا ډیفیوژن ماډل (Eq. 4) سره ښه مناسب دي ، چیرې چې مونومیریک پروټینونه د متوقع خپریدو کوفیفینس لري (انځور 7b) )، ښي پینل).د مجموعو د توزیع کثافات د 1 µm2/s څخه کم دی، او د مونومیریک پروټینونو شاوخوا 1 µm2/s دی.50-100 µm/s؛ارزښتونه د sonicated αS amyloid fibrils او monomeric αS لپاره په جلا توګه د ورته حل شرایطو لاندې خپاره شوي ارزښتونو ته ورته دي44.کله چې موږ د TCCD چاودنې تحلیل (انځور 7c، پورته پینل) سره مجموعه تحلیل کړه، موږ وموندله چې په هر جلا شوي مجموعه (αS/Tau heteroaggregate) کې شاوخوا 60٪ کشف شوي مجموعې دواړه αS او tau لري، شاوخوا 30٪ یوازې شامل دي. tau، یوازې شاوخوا 10٪ αS.د αS/Tau heteroaggregates Stoichiometric تحليل وښودله چې زياتره heteroaggregates په تاو کې بډايه شوي دي (د 0.5 څخه ښکته stoichiometry، په هر مجموع کې د تاو مالیکولونو اوسط شمیر د αS مالیکولونو څخه 4 ځله ډیر دی)، کوم چې زموږ د کار سره مطابقت لري چې په FLIM کې لیدل شوي. تجربې.د FRET تحلیل وښودله چې دا مجموعه دواړه پروټینونه لري، که څه هم پدې قضیه کې د FRET ریښتیني ارزښتونه خورا مهم ندي، ځکه چې په هر مجموع کې د فلوروفورونو ویش په تجربه کې کارول شوي د غیر لیبل شوي پروټین د زیاتوالي له امله تصادفي و.په زړه پورې، کله چې موږ ورته تحلیل د 45,46 بالغ امیلایډ مجموعې - کموالي تاو ډول په کارولو سره ترسره کړل (اضافی شکل وګورئ. 11a,b)، موږ ولیدل چې که څه هم د αS الکتروسټټیک مجموعه ورته وه (اضافی شکل 11c، d)، په coacervate کې د مجموعو جوړولو وړتیا په پراخه کچه کمه شوې وه او FLIM په سیټو تجربو کې ډیری ځایونه کشف کړل، او د جلا شوي مجموعي نمونو لپاره ضعیف کراس - ارتباط منحل لیدل شوي.په هرصورت، د یو لږ شمیر کشف شوي مجموعو لپاره (یوازې د Tau441 لسمه برخه)، موږ ولیدل چې هر مجموعه د دې تاو ډول په پرتله په αS کې بډایه شوې، نږدې 50٪ کشف شوي مجموعې یوازې αS مالیکولونه لري، او αS ډیر متضاد و. .مجموعه (اضافی شکل 11e وګورئ)، د متضاد مجموعو په مقابل کې چې د Tau441 (شکل 6f) لخوا تولید شوي.د دې تجربو پایلې وښودله چې که څه هم αS پخپله د دې وړتیا لري چې په coacervate کې د تاو سره راټول شي، د دې شرایطو لاندې د تاو نیوکلیشن ډیر مناسب دی، او د پایلې په توګه د امیلایډ په څیر مجموعه د αS او tau په توګه عمل کولی شي.په هرصورت، یوځل چې د تاو بډایه کور جوړ شي، د αS او tau ترمنځ heterotypic تعاملات د تاو مالیکولونو ترمنځ د هوموټایپیک تعاملاتو په پرتله په مجموع کې غوره کیږي.موږ د پروټین شبکې په مایع αS/tau coacervates کې هم ګورو.
د αS/Tau441 electrostatic coacervates کې د جلا شوي مجموعو د واحد مالیکولونو نماینده فلوروسینس لنډمهاله نښې.د αS/Tau441 coaggregates سره په مطابقت کې درزونه (د ښودل شوي حد څخه پورته سوځیدل) په دریو کشفي چینلونو کې لیدل شوي (AF488 او Atto647N د مستقیم جوش وروسته، نیلي او سور لیکې، Atto647N غیر مستقیم جوش وروسته اخراج)، FRET، وایلټ لاین).b FCS/FCCS د جلا شوي αS/Tau441 مجموعو د نمونې تحلیل چې د LLPS (کیڼ اړخ) څخه ترلاسه شوي.د AF488 او Atto647N لپاره د Autocorrelation (AC) منحني په ترتیب سره په نیلي او سور کې ښودل شوي، او د کراس ارتباط (CC) منحني د مجموعو سره تړاو لري چې دواړه رنګونه لري په ارغواني کې ښودل شوي.د AC منحني د لیبل شوي مونومیریک او راټول شوي پروټین ډولونو شتون منعکس کوي پداسې حال کې چې د CC منحني یوازې د دوه ګونی لیبل شوي مجموعو خپریدل ښیې.ورته تحلیل ، مګر د ورته حل شرایطو لاندې لکه په جلا ځایونو کې ، نمونې چې یوازې monomeric αS او Tau441 لري په ښي پینل کې د کنټرول په توګه ښودل شوي.c د αS/Tau441 electrostatic coacervates کې د جلا شوي مجموعو د واحد مالیکولونو فلوروسینس فلش تحلیل.د هرې مجموعې لپاره معلومات چې په څلورو مختلفو تکرارونو کې موندل شوي (N = 152) د دوی د سټوچیومیټري، S ارزښتونو، او FRET موثریت (پورته پینل، رنګ بار د پیښې منعکس کوي) په مقابل کې جوړ شوي.د مجموعو درې ډوله توپیر کیدی شي: -αS-یوازې مجموعه د S~1 او FRET~0 سره، Tau-یوازې د S~0 او FRET~1 سره، او متضاد Tau/αS مجموعه د منځني S او FRET اندازې سره. دواړه مارکر پروټینونه چې په هر متفاوت مجموعه کې کشف شوي (N = 100) په ښکته پینل کې ښودل شوي (د رنګ پیمانه پیښه منعکس کوي).خام ډاټا د خام ډیټا فایلونو په بڼه چمتو شوي.
د وخت په تیریدو سره د مایع پروټین کنډنسیټ یا د وخت په تیریدو سره د جیل په څیر یا جامد جوړښتونو ته وده ورکول د کنډنسیټ په ډیری فزیولوژیکي کارونو او همدارنګه په ناروغۍ کې د غیر معمولي پروسې په توګه د امیلایډ مجموعه 7, 48, 49 څخه مخکې راپور شوي. موږ د مرحلې جلا کول او چلند په تفصیل سره مطالعه کوو.LSPT αS په یو کنټرول شوي چاپیریال کې د تصادفي پولیکیشنونو په شتون کې په ټیټ مایکرومولر غلظت او فزیولوژیکي پلوه اړوند شرایطو کې (یادونه وکړئ چې د αS محاسبه شوي فزیولوژیکي غلظت> 1 µM50 دی) ، د LPS د عادي تودوخې په توګه چلول شوي چلند څخه وروسته.موږ وموندله چې αS، چې په فزیولوژیکي pH کې خورا منفي چارج شوي C-ټرمینل سیمه لري، د دې وړتیا لري چې د LLPS له لارې په اوبو کې د پروټین بډایه څاڅکي رامینځته کړي چې د خورا cationic اختلال شوي پیپټایډونو لکه pLK یا Tau په شتون کې د الکتروسټټیک پروسې له لارې. د مجموعې میکرومولیکولونو په شتون کې پیچلي کنډسینشن.دا پروسه ممکن په سیلولر چاپیریال کې اړونده اغیزې ولري چیرې چې αS په ویټرو او ویوو 51,52,53,54 کې دواړه د ناروغۍ پورې تړلي مجموعې سره تړلي مختلف پولیکیشنیک مالیکولونو سره مخ کیږي.
په ډیرو څیړنو کې، په څاڅکو کې د پروټین متحرکات یو له مهمو فکتورونو څخه ګڼل کیږي چې د پخیدو پروسې 55,56 ټاکي.په electrostatic αS کې د پولیکیشنونو سره همغږي کیږي، د پخیدو پروسه په ښکاره ډول د پولیکیشنونو سره د تعاملاتو په ځواک، والینس، او د دې تعاملاتو ضربت پورې اړه لري.د انډول تیوري وړاندیز کوي چې د دوه مایع حالتونو متوازن منظره به د بایوپولیمرونو بډایه لوی څاڅکي شتون وي چې LLPS57,58 چلوي.د څاڅکو وده د Ostwald maturation59، coalescence60 یا په منتشر شوي مرحله کې د وړیا مونومر مصرف په 61 کې ترلاسه کیدی شي.د αS او Tau441، ΔNt-Tau یا pLK لپاره، ډیری پروټین په دې څیړنه کې کارول شوي شرایطو لاندې په کنډنسیټ کې متمرکز وو.په هرصورت، پداسې حال کې چې د بشپړې اندازې تاو څاڅکي د سطحي لمدو په وخت کې په چټکۍ سره یوځای کیږي، د څاڅکو یوځای کول او لوند کول د ΔNt-Tau او pLK لپاره ستونزمن وو، چې په دې دوو سیسټمونو کې د مایع ملکیتونو چټک ضایع وړاندیز کوي.زموږ د FLIM-FRET تحلیل له مخې، د عمر لرونکي pLK او ΔNt-Tau څاڅکي د اصلي څاڅکو په څیر د پروټین راټولولو ورته درجې (د فلوروسینس ژوندانه ورته ورته) ښودلې، دا وړاندیز کوي چې د پروټین اصلي شبکه ساتل شوې وه، که څه هم ډیر سخت وي.
موږ په لاندې ماډل (8 شکل) کې خپلې تجربې پایلې منطقي کوو.په ابتدايي توګه په لنډمهاله توګه جوړ شوي څاڅکي اکثرا د پروټین شبکې دي پرته له الیکټروسټاټیک خساره، او په دې توګه د چارج عدم توازن ساحې شتون لري، په ځانګړې توګه د څاڅکي انټرفیس کې، په پایله کې د څاڅکو په پایله کې د لوړ الیکټروسټاټیک سطح ظرفیت سره.د چارج د جبرانولو لپاره (یوه پدیده چې په عموم کې د valence depletion په نوم یادیږي) او د څاڅکو سطحي احتمال کم کړي ، څاڅکي کولی شي د ضعیف مرحلې څخه نوي پولیپټایډونه شامل کړي ، د پروټین شبکې بیا تنظیم کړي ترڅو د چارج چارج تعاملات اصلاح کړي ، او د نورو څاڅکو سره تعامل وکړي.د سطحو سره (لنده کول).د αS/pLK څاڅکي، د دوی د ساده پروټین شبکې له امله (یوازې د αS او pLK ترمنځ متقابل تعامل) او د پروټین - پروټین تعاملاتو لپاره ډیر تړاو، داسې بریښي چې د کنډنسیټ چارج په چټکۍ سره توازن کړي؛په حقیقت کې، موږ د αS/Tau په پرتله په پیل کې جوړ شوي αS/pLK coacervates کې د پروټین ګړندی حرکتونه ولیدل.د والینس له کمیدو وروسته ، تعاملات لږ لنډمهاله کیږي او څاڅکي خپل مایع ملکیت له لاسه ورکوي او د جیل په څیر غیر سوځیدونکي څاڅکو بدلیږي چې د ټیټ الیکټروسټاټیک سطح ظرفیت سره (او له همدې امله نشي کولی سطح لند کړي).په مقابل کې، αS/Tau څاڅکي د ډیر پیچلي پروټین شبکې (دواړه homotypic او heterotypic تعاملاتو سره) او د پروټین متقابل عمل ضعیف طبیعت له امله د څاڅکي چارج توازن اصلاح کولو کې لږ موثر دي.دا د څاڅکو پایله ده چې د اوږدې مودې لپاره د مایع چلند ساتي او د لوړ الیکټروسټاټیک سطح پوټینشن څرګندوي چې د یوځای کولو او وده کولو له لارې کمیږي (په دې توګه د څاڅکو سطحي ساحه/حجم تناسب کموي) او د هایدروفیلیک سطح کیم لوند کولو سره.دا لوی متمرکز پروټین کتابتونونه رامینځته کوي چې د مایع ملکیتونه ساتي ځکه چې تعاملات د پروټین شبکې کې د چارج اصلاح کولو لپاره د دوامداره لټون له امله خورا لنډمهاله پاتې کیږي.په زړه پورې خبره دا ده چې د تاؤ N-اصطلاحي ټوټې شوي شکلونه، په شمول ځینې طبیعي ډول واقع شوي isoforms62، منځمهاله چلند څرګندوي، ځینې د αS سره د اوږد عمر لرونکي جیل په څیر څاڅکو ته وده ورکوي، پداسې حال کې چې نور په لویو مایع کنډنسټونو بدلیږي.د αS electrostatic coacervates په بشپړتیا کې دا دوه اړخیزه د وروستي LLPS تیوریکي او تجربوي مطالعاتو سره مطابقت لري چې د کنډنسیټ اندازې او د مایع ملکیتونو کنټرول کولو کلیدي په توګه په کنډنسیټونو کې د والینس کمښت او الکتروسټټیک سیوینګ ترمنځ اړیکه پیژني.میکانیزم 58.61.
دا سکیم د αS او Tau441 لپاره د LLPS او LSPT له لارې د امیلایډ راټولولو لاره ښیې.د اضافي anion بډایه (سرخ) او cation بډایه (نیلي) سیمو سره ، αS او tau electrostatic coacervates د قناعت وړ والینس سره د سطحې انرژي ټیټه ده او له همدې امله لږ یووالی لري چې په پایله کې د څاڅکو ګړندي عمر رامینځته کیږي.یو مستحکم غیر راټول شوي جیل حالت ترلاسه کیږي..دا وضعیت د αS/pLK سیسټم په قضیه کې خورا مناسب دی ځکه چې د هغې لوړ تړاو او ساده پروټین - جوړه متقابل عمل شبکه ، کوم چې د جیل په څیر ګړندي لیږد ته اجازه ورکوي.برعکس، څاڅکي د غیر قناعت وړ والینس سره او له همدې امله د پروتین چارج شوي سیمې د تعامل لپاره شتون لري، د کوسرویټ لپاره دا اسانه کوي چې د هایدروفیلیک سطح فیوز او لوند کړي ترڅو د هغې لوړه سطحه انرژي کمه کړي.دا حالت د αS/Tau441 coacervates لپاره غوره دی، کوم چې یو څو اړخیزه پیچلې شبکه لري چې کمزوری Tau-Tau او αS-Tau تعاملات لري.په بدل کې، لوی coacervats به په اسانۍ سره د مایع په څیر ملکیتونه وساتي، د پروټین څخه پروټین ته د نورو تعاملاتو اجازه ورکوي.په نهایت کې، د امیلایډ متفاوت مجموعه چې دواړه αS او tau لري د coacervate مایع کې دننه شکل لري، کوم چې ممکن د شامل شوي بدنونو سره تړاو ولري، کوم چې د نیوروډیجنریټیک ناروغیو نښه ده.
د مایع په څیر لوی جوړښتونه د αS/Tau441 د پخیدو پرمهال رامینځته شوي چې د خورا ګړندۍ مګر متحرک پروټین چاپیریال سره رامینځته شوي او تر یوې اندازې پورې ، αS/ΔNt-Tau coacervates د پروټین د راټولولو لپاره غوره زیرمې دي.موږ په حقیقت کې د دې ډول پروټین کوسرویټس کې د جامد پروټین مجموعو جوړښت لیدلی چې ډیری وختونه دواړه αS او tau لري.موږ وښودله چې دا هیټرو اګریګیټونه د غیر بریښنایی تعاملاتو لخوا ثبات لري ، د امیلایډ ځانګړي ThT رنګونو سره د عادي امیلایډ فایبریلونو په څیر تړلو توان لري ، او واقعیا د مختلف تاثیراتو سره ورته مقاومت لري.αS/tau ټولیزونه چې د LLPS لخوا رامینځته شوي د امیلایډ په څیر ملکیتونه ښودل شوي.په حقیقت کې، د امیلایډ مجموعه کې د Tau کمښت بالغ ډول د مایع الکتروسټټیک کواسرویټ کې د دې متضاد αS مجموعو په جوړولو کې د پام وړ زیان لري.د αS/Tau441 مجموعو جوړښت یوازې د coacervates دننه لیدل شوی، کوم چې د مایع په څیر ځانګړتیاوې ساتي، او هیڅکله نه، که چیرې coacervates / څاڅکي جیل حالت ته نه وي رسیدلی.په وروستي حالت کې، د الکتروسټټیک تعاملاتو زیاتوالی او د پایلې په توګه، د پروټین شبکې سختوالی د پروټینونو اړین جوړښتي بیا تنظیم کولو مخه نیسي ترڅو د امیلایډ نیوکلیشن لپاره اړین نوي پروټین تعاملات رامینځته کړي.په هرصورت، دا په ډیر انعطاف منونکي، د مایع په څیر coacervates کې ترلاسه کیدی شي، کوم چې په پایله کې د مایع پاتې کیدو احتمال لري ځکه چې دوی په اندازې کې زیاتیږي.
دا حقیقت چې د تودوخې مرحله کې د مجموعو رامینځته کول په لوی αS/Tau کنډنسیټونو کې د کوچني څاڅکو په پرتله غوره دي چې په ګړندۍ توګه جیل کیږي ، د هغه فکتورونو پیژندلو تړاو روښانه کوي چې د څاڅکو یوځای کیدل کنټرولوي.په دې توګه، نه یوازې د مرحلې جلا کولو تمایل شتون لري، بلکې د کنډنسیټ اندازه باید د سم فعالیت او همدارنګه د ناروغۍ مخنیوي لپاره کنټرول شي 58,61.زموږ پایلې د αS/Tau سیسټم لپاره د LLPS او LSPT ترمنځ د توازن اهمیت هم روښانه کوي.پداسې حال کې چې د څاڅکي جوړښت ممکن د امیلایډ مجموعې پروړاندې محافظت وکړي د پروټین مونومرونو مقدار کمولو سره چې د سنتریشن شرایطو لاندې شتون لري ، لکه څنګه چې په نورو سیسټمونو کې وړاندیز شوی 63,64، د څاڅکي فیوژن په لوړه کچه کې د څاڅکي فیوژن ممکن د ورو جوړښتي بیا تنظیم کولو له لارې د داخلي پروټین راټولولو لامل شي.د پروټین شبکې..
په ټولیز ډول، زموږ ډاټا د LSPT په شرایطو کې د ډراپ شبکو کې د همغږۍ والینس او ​​مطمین / نا رضایتي تعاملاتو په اړه په کلکه ټینګار کوي.په ځانګړې توګه، موږ وښیو چې د بشپړ اوږدوالی αS/Tau441 کنډنسیټس په اغیزمنه توګه د فیوز او نیوکلیټ کولو توان لري ترڅو د امیلایډ په څیر هیټرو اګریګیټس رامینځته کړي چې دواړه پروټینونه پکې شامل دي او زموږ د تجربو پایلو پراساس د مالیکول میکانیزم وړاندیز کوي.په αS/Tau مایع coacervate کې د دوه پروټینونو ګډه مجموعه چې موږ یې دلته راپور ورکوو ممکن په حقیقت کې د دوه پروټینونو یوځای کولو سره تړاو ولري، کوم چې د ناروغۍ نښه ده، او ممکن د LLPS او LLPS ترمنځ د اړیکو په پوهیدو کې مرسته وکړي. د امیلایډ مجموعه، په نیوروډیجنریشن کې د لوړ چارج شوي IDP لپاره لاره هواروي.
Monomeric WT-αS، cysteine ​​mutants (Q24C-αS، N122C-αS) او ΔCt-αS ډولونه (Δ101-140) په E. coli کې څرګند شوي او پاک شوي لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي.5 mM DTT د αS cysteine ​​mutants په پاکولو کې په ټولو مرحلو کې شامل شوي ترڅو د ډیسلفایډ بانډ جوړیدو مخه ونیسي.Tau441 isoform (پلاسمید له Addgene #16316 څخه ترلاسه شوی)، ΔNt-Tau variant (Δ1–150، د پریمرونو سره د IVA کلون کولو له لارې ترلاسه شوی CTTTAAGAAGGAGAGATACATGATCGCCCACCGCGG، CATATGTATCCTCTCTTCTTAAAGTTAA53variant) د GGCTC5 پریمر سره) د E. coli کلتورونه وو OD600 = 0.6–0.7 ته په 37°C او 180 rpm کې وده وکړه، او د 37°C په حرارت کې د 3 ساعتونو لپاره د IPTG سره څرګندونه وه.حجرې په 11,500 x ګرامه د 15 دقیقو لپاره په 4 سانتي ګراد کې راټول کړئ او د مالګین بفر سره چې 150 mM NaCl لري مینځل کړئ.په لیسز بفر کې د ګولۍ بیا پیلول (20 ملی لیتر په 1 L LB کې: MES 20 mM، pH 6.8، NaCl 500 mM، EDTA 1 mM، MgCl2 0.2 mM، DTT 5 mM، PMSF 1 mM، بینزامیډین، 50 μp0 μpeinMM).د سونیکیشن مرحله په یخ کې د 10 دالونو لپاره د 80٪ پراخوالي سره ترسره شوې (1 دقیقې ، 1 دقیقې بند).په یو الټراساؤنډ کې له 60 ملی لیتر څخه ډیر مه کوئ.E. coli lysates د 20 دقیقو لپاره په 95 ° C کې تودوخه شوي، بیا په یخ کې یخ شوي او د 40 دقیقو لپاره په 127,000 × ګرامه سینټرفیوګ شوي.روښانه شوی سپرناټینټ په 3.5 kDa جھلی باندې تطبیق شوی و (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) او د 4 L د ډایلیسس بفر (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl, D22 mM, EDTA 1 mM) ، PMSF 0.1 mM) د 10 ساعتونو لپاره.د 5 ملی لیتر کیشن تبادلې کالم (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) د انډول بفر (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM m1 mFMS, 2 mM m1mFMS) سره انډول شوی.Tau lysate د 0.22 μm PVDF فلټر له لارې فلټر شوی او په کالم کې د 1 ml/min د جریان په اندازې کې داخل شوی.Elution په تدریجي ډول ترسره شو، تاو د 15-30٪ elution بفر (20 mM MES، pH 6.8، 1 M NaCl، 1 mM EDTA، 2 mM MgCl2، 2 mM DTT، 0.1 mM PMSF) سره جلا شوی و.برخې د SDS-PAGE لخوا تحلیل شوي، او کومې برخې چې د تاو متوقع مالیکولر وزن سره یو بانډ لري د 10 kDa سینټرفیوج فلټر په کارولو سره متمرکز شوي او د بفر سره بدل شوي چې 10 mM HEPES، pH 7.4، NaCl 500 mM او DTT mM لري. د پروټین وروستی غلظت 100 μM و.د پروټین محلول بیا د 0.22 μm PVDF فلټر څخه تیر شو، په چټکۍ سره منجمد او په -80 ° C کې زیرمه شو.پروټین K18 په مهربانۍ سره د پروفیسور البرټو بوفي لخوا چمتو شوی.د چمتووالي پاکوالی د 95% څخه> لکه څنګه چې د SDS-PAGE او MALDI-TOF/TOF لخوا تایید شوی.مختلف سیستینونه په کیمیاوي ډول د AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) یا TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada) سره لیبل شوي.د جذب او MALDI-TOF/TOF لخوا تایید شوي.Tau441، ΔNt-Tau، AggDef-Tau او K18 د ورته پروسیجر په تعقیب د Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH، Siegen، آلمان) په کارولو سره په 191 او 322 پوستونو کې د اصلي سیستین پاتې شونو سره لیبل شوي.د αS او Tau441 لپاره د پاتې پاتې نقشو لپاره خالص چارج د CIDER66 په کارولو سره رامینځته شوی.
سولیډ پولی-ایل-لیسین (pLK DP 90-110 د عرضه کونکي NMR له مخې، الامانډا پولیمر انک، هنټسویل، الاباما، USA) په 10 mM HEPES، 100 mM NaCl، pH 7.4 څخه تر 10 mM غلظت کې منحل شوی، د پروسې لپاره سونیک شوی دقیقې په الټراسونک اوبو حمام کې او په -20 ° C کې ذخیره کړئ.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) او FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) په اوبو کې محلول کېدونکي دي او په LLPS بفر کې په پراخه کچه ویشل شوي.ډیالیزس ککړې مالګې لرې کوي.دوی بیا د سرنج فلټر له لارې د 0.22 μm د سوري اندازې سره فلټر شوي ، او د دوی غلظت د ریفراکټومیټر (میټلر تولیډو ، کولمبس ، اوهایو ، متحده ایالاتو) په کارولو سره محاسبه شوي.د LLPS نمونې د خونې په حرارت درجه کې په لاندې ترتیب کې چمتو شوي: بفر او اخراج مخلوط شوي او 1 mm tris (2-carboxyethyl) فاسفین (TCEP، کاربوسینت، کامپټون، انګلستان)، 1 mm 2,2,2,2-(ایتان- 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic اسید (EDTA, carboxynth) او د 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM) مخلوط.بیا αS او فیوز شوي پولیکیشنونه (اختیارونه pLK یا Tau) اضافه کیږي.د thioflavin-T وخت لړۍ تجربو (ThT, Carbosynth, Compton, UK) لپاره، د ThT ټول غلظت وکاروئ ترڅو د αS غلظت نیمایي وي.په نرمۍ سره مګر په بشپړه توګه سره مخلوط کړئ ترڅو ډاډ ترلاسه شي چې دوی یو شان دي.د هرې برخې غلظت له تجربې څخه تر تجربې پورې توپیر لري، لکه څنګه چې د پایلو برخه کې تشریح شوي.Azide د 0.02٪ (w/v) په غلظت کې کارول کیږي کله چې د تجربې موده له 4 ساعتونو څخه زیاته وي.د LLPS نمونو په کارولو سره د ټولو تحلیلونو لپاره، مخلوط ته اجازه ورکړئ چې د تحلیل څخه دمخه د 5 دقیقو لپاره متوازن شي.د روښنايي توزیع تحلیل لپاره، 150 μl نمونې په غیر پابند 96 څاه مایکرو پلیټونو کې بار شوي (µClear®, black, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) او د چپکونکي فلم سره پوښل شوي.LLPs په CLARIOstar پلیټ ریډر (BMG Labtech, Ortenberg, Germany) کې د حل په مرکز کې د 350 nm جذب اندازه کولو له لارې څارل شوي.تجربې په درې اړخیزه توګه په 25 ° C کې ترسره شوې، او تېروتنې د اوسط څخه د معیاري انحراف په توګه حساب شوي.د ضعیف مرحله د نمونې سینټرفیوګیشن او SDS-PAGE جیل تحلیل لخوا اندازه شوې ، او د αS برخې په ضعیف او متمرکز مرحلو کې په مختلف LLPS حلونو کې اندازه شوې.د 100 μl LLPS نمونه چې د 1 μM AF488 لیبل شوي αS لري د بشپړ مخلوط په واسطه چمتو شوی و او وروسته د 30 دقیقو لپاره په 9600xg کې سینټرفیوګریشن لخوا چمتو شوی و، وروسته له دې چې اورښت معمولا څرګند شو.د سپرناټینټ لوړ 50 μl د SDS-PAGE جیل په کارولو سره د پروټین مقدار کولو لپاره کارول شوی.جیلونه د AF488 فلټرونو سره د ChemiDoc جیل امیجنگ سیسټم (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) په کارولو سره سکین شوي یا د Coomassie داغ سره رنګ شوي او د مناسب فلټرونو سره لیدل شوي.پایله لرونکي بانډونه د ImageJ نسخه 1.53i (د روغتیا ملي انسټیټیوټ، USA) په کارولو سره تحلیل شوي.تجربې د ورته پایلو سره په دوه مختلف تجربو کې په نقل کې ترسره شوې.
په عموم ډول، 150 μl نمونې په غیر پابند 96-څاه مایکروپلیټونو باندې پلي شوي او د لییکا DMI6000B التهاب شوي مایکروسکوپ (لییکا مایکروسیسټم ، ویټزلر ، جرمني) کې د خونې په حرارت کې لیدل شوي.د ځای تجربو لپاره، µ-Slide Angiogenesis plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) یا 96-well polystyrene microplates (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) هم کارول شوي.EL6000 هالوجن یا پارا فلزي هالایډ لامپونه د روښانتیا سرچینې په توګه کارول شوي (په ترتیب سره د BF/DIC او WF امیجنګ لپاره).د WF مایکروسکوپي لپاره، د 40x میګنیفیکیشن هوا هدف (Leica Microsystems, Germany) په نمونه باندې د رڼا تمرکز کولو او راټولولو لپاره کارول شوی و.د AF488 او ThT لیبل شوي نمونو لپاره، د معیاري GFP فلټر سیټونو سره د جوش او اخراج فلټر کول، په ترتیب سره د 460-500 nm او 512-542 nm بانډ پاس فلټرونه، او د 495 nm miorrro dichr.د هغو نمونو لپاره چې د Atto647N سره لیبل شوي، د Cy5 فلټرونو یو معیاري سیټ د جوش او اخراج بانډ پاس فلټرونه په ترتیب سره 628–40 nm او 692–40 nm، او د 660 nm ډیکرویک عکس کارول شوي.د BF او DIC مایکروسکوپي لپاره، د ورته منعکس شوي رڼا راټولولو هدف وکاروئ.راټول شوی رڼا د Leica DFC7000 CCD کیمرې (Leica Microsystems, Germany) کې ثبت شوې.د افشا کولو وخت د BF او DIC مایکروسکوپي امیجنگ لپاره 50 ms او د WF مایکروسکوپي امیجنگ لپاره 20-100 ms و.د پرتله کولو لپاره، د ThT سره د ټولو تجربو لپاره د افشا کولو وخت 100 ms و.د وخت تیریدو تجربې د څاڅکو یوځای کیدو لیدو لپاره ترسره شوې ، د عکسونو سره په هر 100 ms کې د څو دقیقو لپاره راټول شوي.ImageJ (NIH، USA) د عکس تحلیل لپاره کارول کیده.تجربې د ورته پایلو سره په درې اړخیزه توګه ترسره شوې.
د سیمه ایز کولو تجربو، FRAP او 3D بیارغونې لپاره، انځورونه د ZEN 2 نیلي نسخه (کارل زیس AG، اوبرکوچین، آلمان) په کارولو سره په Zeiss LSM 880 بدل شوي کنفوکال مایکروسکوپ کې ترلاسه شوي.د 50 µl نمونې په µ-Slide Angiogenesis Petri dishes (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germany) کې پلي شوي، د هایدروفیلیک پولیمر (ibiTreat) سره درملنه شوي او د 63× د تیلو ډوبیدو هدف کې نصب شوي (Plan-Apochromat 63/14NA) په DIC کې).انځورونه د 458 nm، 488 nm، او 633 nm آرګون لیزر لاینونو په کارولو سره ترلاسه شوي چې د 0.26 µm/pixel ریزولوشن سره او د 8 µs/pixel د افشا کولو وخت د 470–600 – nm – 628nm، 6289 nm، 628nm د جوش او اخراج کشف کړکۍ لپاره او 638-755 nm په ترتیب سره د ThT، AF488 او Atto647N لیدلو لپاره کارول شوي.د FRAP تجربو لپاره، د هرې نمونې د وخت تیریدو عکاسي په یوه ثانیه کې په 1 فریم کې ثبت شوې.تجربې د ورته پایلو سره د خونې د حرارت درجه کې په درې اړخیزه توګه ترسره شوې.ټول انځورونه د زین 2 نیلي نسخه سافټویر (کارل زیس AG، اوبرکوچین، آلمان) په کارولو سره تحلیل شوي.د FRAP منحني نورمال شوي ، پلاټ شوي او د شدت / وخت ډیټا سره فټ شوي چې د زین 2 په کارولو سره د OriginPro 9.1 په کارولو سره له عکسونو څخه ایستل شوي.د بیا رغولو منحني منحني موډل ته د مالیکولر خپریدو حساب ورکولو لپاره د اضافي مصرفي اصطلاح سره د استملاک بلیچنګ اغیز محاسبه کولو لپاره فټ شوي.بیا موږ د نومي بلیچنګ وړانګو په کارولو سره D محاسبه کړه او د مخه ټاکل شوي د رغیدو نیم ژوند لکه څنګه چې د کانګ ایټ ال مساوات کې.5 35 ښودل شوي.
د αS واحد سیستین ډولونه د 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) سره په 24 (TEMPOL-24-αS) او 122 (TEMPOL-122-αS) کې ترکیب شوي، په ترتیب سره.د سپن لیبل کول د EPR تجربو لپاره، د αS غلظت په 100 μM کې ټاکل شوی او د PEG غلظت 15٪ (w/v) و.د مختلفو مجموعو شرایطو لپاره، د αS:pLK نسبت 1:10 و، پداسې حال کې چې د αS:ΔNt-Tau او αS:Tau441 نسبت په 1:1 کې ساتل شوي.د ګڼې ګوڼې په نشتوالي کې د باندني ټیکټریشن تجربو لپاره، TEMPOL-122-αS په 50 μM کې ساتل شوی و او پولیکیشنونه د غلظت په زیاتوالي کې ټایټ شوي، هر حالت په جلا توګه چمتو کوي.د CW-EPR اندازه کول د Bruker ELEXSYS E580 X-band سپیکٹرومیټر په کارولو سره ترسره شوي چې د Bruker ER4118 SPT-N1 ریزونټر سره سمبال شوي چې د مایکروویو (SHF) فریکونسۍ ~ 9.7 GHz کې فعالیت کوي.د تودوخې درجه په 25 ° C کې ټاکل شوې وه او د مایع نایتروجن کریوسټاټ لخوا کنټرول شوې.سپیکٹرا د غیر مطمئن شرایطو لاندې د 4 میګاواټه بریښنا، د 0.1 mT د ماډلولیشن طول، او د 100 kHz د ماډلولو فریکونسۍ کې ترلاسه شوي.د تمثیل شدت نورمال شوی و ترڅو د نمونو تر مینځ د سپن غلظت کې د توپیر څخه مخنیوی وشي او د Tau441 یا ΔNt-Tau (په اصلي پروټین حلونو کې شتون لري) په نمونو کې د کمولو اجنټانو پاتې کیدو غلظت له امله د نمونو او احتمالي سپن کمولو څخه مخنیوی وشي.د g ورکړل شوي ارزښتونه په Matlab®67 کې پلي شوي Easyspin سافټویر (v. 6.0.0-dev.34) په کارولو سره د EPR سپیکٹرل ماډلینګ په پایله کې ترلاسه شوي.د ډیټا ماډل کولو لپاره یو / دوه اجزاو اسوټروپیک ماډلونه کارول شوي.د ټولو سیګنالونو نورمال کولو وروسته، پاتې شوني د اړونده تجربوي طیف څخه د هر سمولیشن په کمولو سره محاسبه شوي.د پابندۍ ټیکټریشن تحلیل لپاره، د نورمال شوي EPR سپیکٹرم (IIII/III) دویم بډ ته د دریم بډ نسبي شدت αS ته د پولیکیشنونو پابندۍ نظارت لپاره کارول کیده.د جلا کولو ثابت (Kd) اټکل کولو لپاره، پایله لرونکی وکر په اټکل شوي ماډل کې نصب شوی و چې د ورته او خپلواک پابند سایټونو په نظر کې نیولو سره.
د NMR سپیکٹروسکوپي تجربې د Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR سپیکٹرومیټر په کارولو سره ترسره شوې چې په کریوپروب او Z-gradient سره سمبال شوي.ټولې تجربې د 130-207 µM αS په کارولو سره ترسره شوې او په 10 mm HEPES، 100 mM NaCl، 10٪ DO، pH 7.4 کې ورته αS/ΔNt-Tau او pLK معادل او په 15 ° C کې ترسره شوي.د NMR لخوا د LPS څارلو لپاره، 10٪ PEG مخکې مخلوط نمونو کې اضافه شوي.د کیمیاوي بدلون د ګډوډۍ پلاټ (Fig. 1b) اوسط 1H او 15N کیمیاوي بدلونونه ښیي.د αS 2D1H-15N HSQC سپیکٹرا د پخوانۍ دندې (BMRB داخله #25227) پراساس ګمارل شوي او د HNCA, HNCO او CBCAcoNH 3D سپیکٹرا ثبتولو او تحلیل کولو سره تایید شوي.13Cα او 13Cβ کیمیاوي بدلونونه د ΔNt-Tau یا pLK په شتون کې محاسبه شوي ترڅو د αS کیمیاوي بدلونونو په پرتله د خالص تصادفي کویل جوړښت 68 (ضمیمي شکل 5c) کې د ثانوي جوړښت رجحاناتو کې ممکن بدلونونه اندازه کړي.د R1ρ نرخونه د hsqctretf3gpsi تجربو ثبتولو سره اندازه شوي (د بروکر کتابتون څخه ترلاسه شوي) د 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, او 800 ms ځنډونو سره، او د اضافې دندې په مختلف ډولونو کې د ځنډ لوړوالي سره تنظیم شوي. د R1ρ او د هغې تجربوي ناڅرګندتیا ټاکلو لپاره وختونه.
د دوه رنګه وخت حل شوي فلوروسینس مایکروسکوپي تجربې د سوداګریز وخت حل شوي MT200 فلوروسینس کنفوکال مایکروسکوپ (PicoQuant، برلین، آلمان) کې د وخت سره تړلي واحد فوټون شمیرنې (TCSPC) وسیله سره ترسره شوې.د لیزر ډایډ سر د pulsed interleaved excitation (PIE) لپاره کارول کیږي، بیم د واحد موډ ویو ګایډ څخه تیریږي او د 481 nm او 637 nm لیزر لاینونو لپاره د 10 څخه تر 100 nW لیزر ځواک ته ټون کیږي چې د ډیکرویک عکس وروسته اندازه کیږي.دا د فوټون د شمیرنې مطلوب نرخ تضمینوي ، د فوټون ایلیسینګ ، فوتو بلیچ کولو او سنتریت اغیزو څخه مخنیوی کوي.μ-Slide angiogenesis coverslips یا plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) په مستقیم ډول په اوبو کې د سوپر اپوکرومیټ 60x NA 1.2 لینز سره د اصلاحي کالر سره ځای په ځای شوي وو (اولمپس ژوند علومو، والتم، امریکا).A 488/640 nm dichroic Mirror (Semrock, Lake Forest, IL, USA) د اصلي بیم سپلیټر په توګه کارول کیده.غیر متمرکز وړانګې د 50 مایکرون قطر سره د سوري په واسطه بندیږي ، بیا متمرکز وړانګې د 50/50 بیم سپلیټر لخوا په 2 کشفي لارو ویشل کیږي.د بانډ پاس اخراج فلټرونه (سیمروک، لیک فارسټ، IL، USA) د شین رنګ لپاره 520/35 (AF488) او 690/70 د سور رنګ (Atto647N) لپاره د کشف کونکي مخې ته کارول شوي.د واحد فوټون واورین ډایډز (SPAD) (د مایکرو فوټون وسایل، بولزانو، ایټالیا) د کشف کونکو په توګه کارول شوي.د معلوماتو راټولول او تحلیل دواړه په سوداګریز ډول د SymphoTime64 سافټویر (PicoQuant GmbH، برلین، آلمان) په کارولو سره ترسره شوي.
پنځوس مایکرو لیټر LLPS نمونې د μ-Slide angiogenesis څاګانو (Ibidi GmbH، Gräfelfing، آلمان) کې تطبیق شوي.نتیجه اخیستونکي عکسونه د تعلیق شوي څاڅکو لپاره د غوره هدف کاري فاصلې لپاره د څاه لاندې 20 µm پورته او د رافټ او نقطو لپاره ~ 1 µm ته متمرکز شوي چې لږترلږه 0.25 µm/pixel محوری ریزولوشن سره او د ځنډ وخت 400 µs/pixel.د هر چینل لپاره د اوسط شالید سیګنال شدت (PBG، معنی + 2σ) پراساس د شدت حد پلي کولو له لارې ډاټا غوره کړئ ترڅو یوازې د مایع پروټین څاڅکي، رافټ یا ځایونه وټاکل شي، د منحل شوي مرحلې څخه هر ممکنه سرچینه فلټر کول.د هر چینل د هر نوع (τ) د ژوند د تحلیل لپاره (شنه، "g" د AF488 لپاره او سور، "r" د Atto647N لپاره)، موږ د علاقې وړ سیمې (ROIs) غوره کړې چې څاڅکي، رافټونه، یا ځایونه لري (اضافی شکل 1 ).8b) او په هر چینل کې د tail-fit analysis او د دوه برخو د تخریب ماډل په کارولو سره د دوی د ژوند دورې تخریب (τD، τR او τP په ترتیب سره د څاڅکو، رافټ یا داغونو لپاره، ضمیمه انځور 8c وګورئ) په ترتیب سره ترلاسه کړي.اوسط τ له τ څخهROIs چې د څو اړخیز فټ لپاره خورا لږ فوټونونه تولید کړي له تحلیل څخه ایستل شوي.کارول شوی کټ آف د رافټ او نقطو لپاره <104 فوټونونه او د څاڅکو لپاره 103 وو.څاڅکي ټیټ حد لري ځکه چې د لوړ شدت ارزښتونو سره د تخریب منحني ترلاسه کول ستونزمن دي ځکه چې د عکس په ساحه کې څاڅکي معمولا کوچني او لږ شمیر وي.ROIs چې د فوټون شمیرې سره د فوټون راټولولو حد څخه پورته دي (>500 شمیرې/پکسل ته ټاکل شوي) هم د تحلیل لپاره رد شوي.د علاقې له سیمې څخه ترلاسه شوي د شدت تخریب وکر د خدمت د ژوند له پیل څخه د اعظمي 90٪ شدت سره (د تخریب د اعظمي شدت څخه لږ وروسته) سره مطابقت کړئ ترڅو د IRF لږترلږه مداخله یقیني کړي پداسې حال کې چې د ټولو شدت تخریب لپاره ورته ساتل کیږي. ترتیبات د اړونده وخت کړکۍ د رافټ او ځایونو لپاره له 25 څخه تر 50 ROI او د څاڅکو لپاره 15-25 ROI تحلیل شوي، انځورونه د 4 څخه زیات نقلونو څخه غوره شوي چې لږترلږه د 3 خپلواک تجربو څخه ثبت شوي.دوه اړخیزه ټیسټونه د ډولونو او یا هم د coacervate سیسټمونو ترمنځ د احصایوي توپیرونو ارزولو لپاره کارول شوي.د ژوند دورې د پکسل په واسطه د پکسل تحلیل لپاره (τ)، د هر چینل لپاره د ساحې په اوږدو کې د ژوند دوره ټوله توجه محاسبه شوې او د 2/3 اجزاو د توسعې توزیع ماډل اټکل شوی.د هر پکسل لپاره د ژوند دوره توزیع بیا د مخکینیو محاسبه شوي τ ارزښتونو په کارولو سره فټ شو، په پایله کې د سیډوکولر FLIM فټ عکس.د tail-fit د ژوند دوره د ورته چینل په ټولو عکسونو کې یو شان وه، او هر تخریب د اعتبار وړ فټ چمتو کولو لپاره کافي فوټون تولیدوي.د FRET تحلیل لپاره، پکسلونه د 100 فوټونونو د ټیټ شدت حد په پلي کولو سره غوره شوي، کوم چې په اوسط ډول د 11 فوټونونو شالید سیګنال (FBG) دی.د هر چینل د فلوروسینس شدت د تجربوي ټاکل شوي اصالحاتو فکتورونو لخوا سم شوی: 69 سپیکٹرل کراسټالک α 0.004 و، مستقیم جوش β 0.0305 و، د کشف موثریت γ 0.517 و.د پکسل په کچه د FRET موثریت بیا د لاندې مساواتو په کارولو سره محاسبه کیږي:
چیرې چې FDD د فلوروسینس شدت دی چې په ډونر (شنه) چینل کې لیدل کیږي، FDA د فلوروسینس شدت دی چې د غیر مستقیم حوصلې لاندې په قبول کونکي (سرخ) چینل کې لیدل کیږي، او FAA د فلوروسینس شدت دی چې د مستقیم حوصلې لاندې د قبول کونکي (سر) چینل کې لیدل کیږي. PIE).په چینل کې د فلوروسینس شدت نبض لیدل کیږي).
100 µl LLPS عکس العمل محلولونه چې 25 µM بې لیبل شوي مونومیریک Tau441 لري (د 25 µM αS سره یا پرته) په LLPS بفر کې (د پورتنۍ په څیر ضمیمه شوي) په غیر پابند 96-څاه مایکرو پلیټونو کې د چپکونکي ورق کوټ کولو سره ځای په ځای کړئ او د مایکروکوف فارمټیشن وروسته د WF لخوا چک شوي. انډولپه 10 دقیقو کېد خونې په حرارت کې د 48 ساعتونو انکیوبیشن وروسته، د پروټین رافټونو او داغونو شتون تایید شو.بیا په احتیاط سره د څاګانو څخه د رافټونو څخه مایع لرې کړئ، بیا 50 L د جلا کولو بفر (10 mM HEPES، pH 7.4، 1 M NaCl، 1 mM DTT) اضافه کړئ او د 10 دقیقو لپاره یې وینځئ.د مالګې لوړ غلظت دا یقیني کوي چې LLPS به د پاتې پاتې PEG له امله تکرار نشي، او د پروټین ممکنه ټولګه چې یوازې د الیکټروسټاټیک تعاملاتو لخوا رامینځته کیږي جلا شي.بیا د څاه لاندینۍ برخه په احتیاط سره د مایکروپیپټ ټیپ سره وتړل شوه او پایله شوې محلول خالي مشاهده څاه ته لیږدول شوي.د 1 h لپاره د 50 μM ThT سره د نمونو انکیوبیشن وروسته، د جلا شوي ځایونو شتون د WF مایکروسکوپي لخوا معاینه شو.د سونیک شوي αS فایبریلونه د 70-µM αS محلول 300 μl په PBS کې د pH 7.4 سره، سوډیم ایزایډ 0.01٪ په 37 °C کې او 200 rpm په اوربیټل شیکر کې د 7 ورځو لپاره چمتو کړئ.محلول بیا د 30 دقیقو لپاره په 9600×g کې سینټرفیوژ شوی و، ګولۍ د PBS pH 7.4 کې بیا ځای پرځای شوې او سونیکیټ شوې (1 دقیقه، 50٪ سایکل، 80٪ په Vibra-Cell VC130 sonicator، Sonics, Newton, USA) فایبریل نمونه کې د کوچنیو فایبریلونو نسبتا یونیفورم ویش سره.
د FCS/FCCS تحلیل او دوه رنګه اتفاق کشف (TCCD) په ورته MT200 وخت کې حل شوي فلوروسینټ کنفوکال مایکروسکوپ (Pico-Quant, Berlin, Germany) کې ترسره شوي چې د PIE حالت په کارولو سره د FLIM-FRET مایکروسکوپي تجربو لپاره کارول شوي.د دې تجربو لپاره د لیزر ځواک 6.0 µW (481 nm) او 6.2 µW (637 nm) ته اضافه شوی.د دې لیزر ځواک ترکیب غوره شوی و چې د فلوروفورونو جوړو لپاره ورته روښانتیا تولید کړي پداسې حال کې چې د غوره شمیرنې نرخونه ترلاسه کوي او د فوتو بلیچ کولو او سنتریت څخه مخنیوی کوي.د معلوماتو راټولول او تحلیل دواړه په سوداګریز ډول موجود SymphoTime64 نسخه 2.3 سافټویر (PicoQuant, Berlin, Germany) په کارولو سره ترسره شوي.
د جلا شوي αS/Tau مجموعو نمونې چې د LLPS په کارولو سره ترلاسه شوي په جلا کولو بفر کې د مناسب مونومولیکولر غلظت (معمولا د 1:500 کمیدو سره ، ځکه چې مجموعې دمخه په ټیټ غلظت کې وي کله چې د coacervate نمونو څخه جلا کیږي).نمونې په مستقيمه توګه د 1 mg/mL په غلظت کې د BSA محلول سره مخ پر پوښل شوي پوښ (کورنینګ، USA) کې پلي شوي.
په شنه او سور چینلونو کې د PIE-smFRET تحلیل لپاره، د 25 فوټون ټیټ شدت حد د مونومیریک پیښو له امله رامینځته شوي ټیټ شدت سیګنالونو فلټر کولو لپاره پلي شوی و (یادونه وکړئ چې مونومر د جلا شوي مجموعو په پرتله د راټول شوي نمونو څخه ډیر دي).دا حد د خالص مونومر نمونو تحلیل څخه ترلاسه شوي د مونومیریک αS اوسط شدت پنځه چنده حساب شوی ترڅو په ځانګړي ډول د تحلیل لپاره مجموعه غوره کړي.د PIE ډرایو سرکټ، د TSCPC ډیټا استملاک سره یوځای، د ټول عمر وزن کولو فلټر غوښتنلیک فعال کړی چې د شالید او سپیکٹرل کراسټالک له منځه وړلو کې مرسته کوي.د پورته حدونو په کارولو سره ټاکل شوي د سوځیدنې شدت د اوسط شالید سیګنال په کارولو سره سم شوی چې د پیښې هسټوګرامونو څخه ټاکل شوي د شدت/بفر یوازې نمونو په پرتله.د لویو مجموعو سره تړلي درزونه معمولا د وخت په تعقیب کې څو پرله پسې ډنډونه نیسي (1 ms ته ټاکل شوي).په دې قضیو کې، د اعظمي ځواک یو بن غوره شوی.د FRET او stoichiometric تحلیل لپاره، په تیوریکي توګه ټاکل شوي ګاما فکتور γ (0.517) کارول شوي.د سپیکٹرل کراسسټالک او مستقیم جوش ونډې د استخراج لیزر ځواک کې د پام وړ نه دي (په تجربوي ډول ټاکل شوي).په یوه چاودنه کې د FRET موثریت او stoichiometry په لاندې ډول محاسبه کیږي.