د Nature.com لیدلو لپاره مننه.تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).برسېره پردې، د روان ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کوو.
سلایډونه په هر سلایډ کې درې مقالې ښیې.د هر سلایډ له لارې حرکت کولو لپاره شاته او بل بټن وکاروئ، یا د سلایډ کنټرولر بټن په پای کې د هر سلایډ له لارې حرکت وکړئ.

317 د سټینلیس سټیل کویل ټیوب عرضه کونکي

د سټینلیس فولادو موادو کیمیاوي ترکیب جدول

SPACA6 د سپرم څرګند شوي سطحي پروټین دی چې د تی لرونکو جنسي تکثیر پرمهال د ګیمیټ فیوژن لپاره مهم دی.د دې بنسټیز رول سره سره، د SPACA6 ځانګړی فعالیت په خراب ډول نه پوهیږي.موږ د 2.2 Å په ریزولوشن کې د SPACA6 د بهر سیلولر ډومین کرسټال جوړښت روښانه کوو، د دوه ډومین پروټین په ګوته کوي چې د څلور ډنډونو بنډل او Ig-like β-sandwiches څخه جوړ شوي د نیم انعطاف وړ لینکرونو لخوا یوځای شوي.دا جوړښت د IZUMO1 سره ورته دی، یو بل ګیمیټ فیوژن پورې تړلی پروتین، چې د SPACA6 او IZUMO1 بنسټ ایښودونکي غړي جوړوي چې د سرې سره تړلي پروټینونو عالي کورنۍ ته دلته د IST سوپر فامیل په توګه راجع کیږي.IST سوپر فامیل په ساختماني ډول د دې دوه اړخیز څلور هیلکس بنډل او یو جوړه ډیسلفایډ پورې تړلي CXXC شکلونو لخوا تعریف شوی.د انسان پروټوم د جوړښت پر بنسټ الفا فولډ لټون د دې عالي کورنۍ اضافي پروټین غړي په ګوته کړل.د پام وړ، ډیری دا پروټینونه د ګیمیټ فیوژن کې ښکیل دي.د SPACA6 جوړښت او د IST نورو غړو سره د هغې اړیکې په عالي کورنۍ کې زموږ د تی لرونکي ګیمیټ فیوژن په پوهه کې ورک شوي لینک چمتو کوي.
د هر انسان ژوند د دوه جلا هاپلوایډ ګیمیټ سره پیل کیږي: د پلار سپرم او د مور هګۍ.دا سپرم د انتخاب د یوې شدیدې پروسې ګټونکی دی چې په ترڅ کې یې په میلیونونو سپرم حجرې د ښځینه تناسلي لارې څخه تیریږي، مختلف خنډونه لرې کوي او د ظرفیت څخه تیریږي، کوم چې د دوی حرکت او د سطحې اجزاو پروسې ته وده ورکوي 2,3,4.حتی که سپرم او oocyte یو بل ومومي، پروسه لا پای ته نه ده رسیدلې.oocyte د cumulus حجرو د یوې طبقې او د zona pellucida په نوم د ګلیکوپروټین خنډ لخوا محاصره شوی، چې سپرم باید د oocyte ته د ننوتلو لپاره تیریږي.Spermatozoa د دې وروستي خنډونو د لرې کولو لپاره د سطحې چپکونکي مالیکولونو او جھلی پورې تړلي او پټ شوي انزایمونو ترکیب کاروي.دا مالیکولونه او انزایمونه په عمده توګه په داخلي غشا او اکروسومال میټرکس کې زیرمه کیږي او کشف کیږي کله چې د سپرم بهرنۍ غشا د اکروسومال عکس العمل په جریان کې لیس شي 6.په دې شدید سفر کې وروستی ګام د سپرم هګۍ فیوژن پیښه ده، په کوم کې چې دوه حجرې خپل غشا فیوز کوي ترڅو یو واحد ډیپلوډ ارګانیزم شي.که څه هم دا پروسه د انسان په تکثیر کې خورا مهم دی، اړین مالیکولر تعاملات په کمزوري توګه نه پوهیږي.
د ګیمیتونو د القاح سربیره، د دوه لیپید بیلیرونو د فیوژن کیمیا په پراخه کچه مطالعه شوې.په عموم کې، د جھلی فیوژن یو له انرژی پلوه نامناسب پروسه ده چې د پروټین کتلست ته اړتیا لري ترڅو د ساختماني جوړښت بدلون سره مخ شي چې دوه غشا سره نږدې راوړي، د دوی دوام ماتوي او د 8,9 فیوژن لامل کیږي.دا پروټین کتلستونه د فیوزوجن په نوم پیژندل شوي او په بې شمیره فیوژن سیسټمونو کې موندل شوي.دوی کوربه حجرو ته د ویروس د ننوتلو لپاره اړین دي (د مثال په توګه په HIV-1 کې gp160، په کورونویرس کې سپکاوی، د انفلوینزا ویروسونو کې هیماګلوټینین) 10,11,12 پلیسینټل (سینسیټین) 13,14,15 او په ټیټ یوکریوټس کې د ګیمیټ جوړونکي فیوژن ( HAP2/GCS1 په نباتاتو، پروټیسټانو او ارتروپډونو کې) 16,17,18,19.د انسان ګیمیټونو لپاره فوسوګین تر اوسه ندي موندل شوي، که څه هم ډیری پروټینونه د ګیمیټ ضمیمه او فیوژن لپاره مهم ښودل شوي.د oocyte-expressed CD9، یو ټرانس میمبرین پروټین دی چې د موږک او انسان ګیمیتونو د فیوژن لپاره اړین دی، لومړی ځل و چې په 21,22,23 کې کشف شو.که څه هم د دې دقیق فعالیت روښانه نه دی، په چپکولو کې رول، د هګۍ مایکرویلیل کې د اډیشن فوسي جوړښت، او/یا د oocyte سطحي پروټینونو سم ځایی کول احتمال 24,25,26 ښکاري.دوه خورا عام پروټینونه چې د ګیمیټ فیوژن لپاره مهم دي د سپرم پروټین IZUMO127 او oocyte پروټین JUNO28 دي، او د دوی دوه اړخیزه اړیکه د فیوژن دمخه د ګیمیټ پیژندلو او چپکولو کې یو مهم ګام دی.نارینه Izumo1 ناک آوټ موږک او ښځینه جونو ناک آوټ موږکونه په بشپړ ډول جراثیمي دي، په دې ماډلونو کې سپرم د پیرویټیلین ځای ته ننوځي مګر ګیمیټونه فیوز نه کوي.په ورته ډول، کنګلیشن کم شو کله چې ګیمیتونه د انټي IZUMO1 یا JUNO27,29 انټي باډیز سره په انسان کې د ویټرو القاح تجربو کې درملنه شوي.
په دې وروستیو کې، د سپرم څرګند شوي پروټینونو نوې کشف شوې ډله په فینوټایپیک ډول د IZUMO1 او JUNO20,30,31,32,33,34,35 سره ورته ده.د سپرم اکروسومل جھلی پورې تړلی پروتین 6 (SPACA6) د لوی پیمانه مورین میوټاګینسیس مطالعې کې د القاح لپاره اړین پیژندل شوی.Spaca6 جین ته د ټرانسجین داخلول غیر انډول سپرماتوزا تولیدوي، که څه هم دا سپرماتوزا د پیرویټیلین ځای 36 ته ننوځي.په موږکانو کې د ناک آوټ وروستیو مطالعاتو تایید کړه چې Spaca6 د ګیمیټ فیوژن 30,32 لپاره اړین دی.SPACA6 تقریبا په ځانګړي ډول په ټیسټونو کې څرګند شوی او د IZUMO1 سره ورته ځایی کولو نمونه لري، د بیلګې په توګه د اکروسومال عکس العمل دمخه د سپرماتوزا په انټیما کې، او بیا د اکروسومال غبرګون 30,32 وروسته استوایی سیمې ته مهاجرت کوي.Spaca6 homologues په مختلفو تی لرونکو حیواناتو او نورو eukaryotes 30 کې شتون لري او د انسان ګیمیټ فیوژن لپاره د دې اهمیت د SPACA6 30 په وړاندې د مقاومت په واسطه په ویټرو کې د انسان القاح مخنیوی لخوا ښودل شوی.د IZUMO1 او JUNO برعکس، د SPACA6 جوړښت، تعامل، او فعالیت توضیحات ناڅرګند پاتې دي.
د انسان د سپرم او هګیو د فیوژن د بنسټیز پروسې د ښه پوهیدو لپاره، کوم چې به موږ د کورنۍ پالن جوړونې او زیږون درملنې په برخه کې د راتلونکي پرمختګونو څخه خبر کړو، موږ د SPACA6 ساختماني او بایو کیمیکل مطالعات ترسره کړل.د SPACA6 د خارجي حجرو ډومین کرسټال جوړښت د څلور هیلیکل بنډل (4HB) او د امیونوګلوبولین په څیر (Ig-like) ډومین ښیې چې د نیم انعطاف وړ سیمو لخوا وصل شوی.لکه څنګه چې په تیرو مطالعاتو کې وړاندوینه شوې، 7,32,37 د SPACA6 ډومین جوړښت د انسان IZUMO1 سره ورته دی، او دوه پروټینونه یو غیر معمولي بڼه شریکوي: 4HB د مثلثي هیلیک سطح سره او د ډیسلفایډ سره تړل شوي CXXC شکلونه.موږ وړاندیز کوو چې IZUMO1 او SPACA6 اوس د ګیمیټ فیوژن سره تړلي پروټینونو لوی، ساختماني اړوند سوپر فامیل تعریفوي.د سوپر فامیل لپاره د ځانګړو ځانګړتیاو په کارولو سره، موږ د الفا فولډ ساختماني انساني پروټوم لپاره یوه بشپړه پلټنه ترسره کړه، د دې سوپر فامیل اضافي غړي وپیژني، په شمول د ګیمیټ فیوژن او/یا القاح کې ښکیل ډیری غړي.اوس داسې ښکاري چې د ګیمیټ فیوژن سره تړلي پروټینونو یو عام جوړښتي پوښ او عالي کورنۍ شتون لري ، او زموږ جوړښت د انسان د ګیمیټ فیوژن میکانیزم د دې مهم اړخ مالیکولر نقشه چمتو کوي.
SPACA6 یو واحد پاس ټرانس میمبرین پروټین دی چې د یو N سره تړلی ګلایکان او شپږ پوټینټ ډیسلفایډ بانډونه لري (شکل S1a او S2).موږ د انسان SPACA6 (27-246 پاتې شونو) د ډروسوفیلا S2 حجرو کې د بهر سیلولر ډومین څرګند کړ او پروټین یې د نکل تړاو، کیشن ایکسچینج، او د اندازې جلا کولو کروماتګرافي (انځر S1b) په کارولو سره پاک کړ.پاک شوی SPACA6 ایکټوډومین خورا باثباته او یو شان دی.د اندازې جلا کولو کروماتګرافي په کارولو سره تحلیل چې د پولیګونال ر lightا توزیع (SEC-MALS) سره یوځای شوی د 26.2 ± 0.5 kDa (انځور S1c) حساب شوي مالیکولر وزن سره یوه څوکه څرګنده کړه.دا د SPACA6 monomeric ectodomain د اندازې سره مطابقت لري، دا په ګوته کوي چې د پاکولو په وخت کې oligomerization نه پیښیږي.برسېره پردې، سرکلر ډیکروزم (CD) سپیکٹروسکوپي د α/β مخلوط جوړښت په ډاګه کړ چې د خټکي نقطه 51.3 °C (انځور S1d,e).د CD سپیکٹرا له منځه وړل د 38.6٪ α-helical او 15.8٪ β-stranded عناصر (انځور S1d) په ګوته شوي.
د SPACA6 ایکټوډومین د تصادفي میټریکس تخم کولو 38 په کارولو سره کریسټال شوی و چې پایله یې د 2.2 Å ریزولوشن سره ډیټا سیټ (جدول 1 او شکل S3).د جوړښت د ټاکلو لپاره د برومایډ افشا کولو سره د ټوټې پراساس مالیکولر بدیل او د SAD مرحله کولو ډیټا ترکیب کارول (جدول 1 او شکل S4) ، وروستی اصلاح شوی ماډل د 27-246 پاتې شونو څخه جوړ دی.په هغه وخت کې چې جوړښت ټاکل شوی و، هیڅ تجربه یا الفا فولډ جوړښت شتون نلري.د SPACA6 اکټوډومین اندازه 20 Å × 20 Å × 85 Å لري، اوه هلیکسونه او نهه β-ډنډونه لري، او یو اوږد شوی دریم فولډ لري چې د شپږو ډیسلفایډ بانډونو لخوا ثبات لري (انځور 1a، b).د Asn243 اړخ سلسلې په پای کې د الکترون ضعیف کثافت دا په ګوته کوي چې دا پاتې شونه د N سره تړلي ګلایکوسیلیشن دی.جوړښت دوه ډومینونه لري: یو N-ټرمینل څلور-هیلکس بنډل (4HB) او د C-ټرمینل Ig په څیر ډومین چې د دوی تر مینځ د مینځنۍ قبضې سیمه لري (انځور 1c).
د SPACA6 د بهر حجرو ډومین جوړښت.د SPACA6 د بهر حجرو ډومین پټه ډیاګرام، د زنځیر رنګ له N څخه تر C-ټرمینس پورې له تیاره نیلي څخه تیاره سور ته.د ډیسلفایډ بانډونو کې دخیل سیستینونه په میګینټا کې روښانه شوي.b د SPACA6 د بهر حجرو ډومین ټوپولوژي.د ورته رنګ سکیم څخه کار واخلئ لکه څنګه چې په 1a شکل کې دی.c SPACA6 بهر سیلولر ډومین.د 4HB، قبضه، او Ig په څیر د ډومین پټې چارټونه په ترتیب سره نارنجي، شنه او نیلي رنګ شوي دي.پرتونه د اندازې لپاره نه راښکته کیږي.
د SPACA6 په 4HB ډومین کې څلور اصلي هیلیکسونه شامل دي (هیلیکس 1-4)، کوم چې د هیلیلیک هیلکس (Fig. 2a) په بڼه ترتیب شوي، د ضد متوازي او موازي تعاملاتو (Fig. 2b) ترمنځ بدیل.یو کوچنی اضافي واحد بدلیدونکی هیلکس (هیلکس 1′) د بنډل سره په عمدي توګه ایښودل شوی، د هیلیکس 1 او 2 سره یو مثلث جوړوي. دا مثلث د 3 او 4 د نسبتا کثافاتو بسته بندۍ په هیلیلیک-ټوست شوي بسته کې یو څه خراب شوی دی ( انځور 2a).
د 4HB N-ټرمینل پټې چارټ.b د څلورو هیلکسونو د بنډل پورته لید، هر هیلکس په N-ټرمینس کې په تیاره نیلي او په C-ټرمینس کې تیاره سور روښانه شوی.c د 4HB لپاره د پورته څخه ښکته سرپل څرخ ډیاګرام، د هرې پاتې شونو سره د یوې حلقې په توګه ښودل شوي چې د یو واحد لیک امینو اسید کوډ سره لیبل شوي؛د څرخ په سر کې یوازې څلور امینو اسیدونه شمیرل کیږي.غیر قطبي پاتې شنې ژیړ رنګ لري، د قطبي نه چارج شوي پاتې شنه رنګ شوي، مثبت چارج شوي پاتې شنه رنګ نیلي دي، او په منفي ډول چارج شوي پاتې شنه سور رنګ لري.d د 4HB ډومین مثلث مخونه، په نارنجي کې 4HB سره او په شنه رنګ کې ځړول.دواړه انسیټونه د راډ په شکل ډیسلفایډ بانډونه ښیې.
4HB په یو داخلي هایدروفوبیک کور باندې متمرکز دی چې په عمده توګه د الیفاټیک او اروماتیک پاتې شونو څخه جوړ شوی دی (انځور 2c).اصلي برخه د Cys41 او Cys55 تر منځ د ډیسلفایډ بانډ لري چې د 1 او 2 هیلسونه په یو لوړ پورته شوي مثلث کې سره نښلوي (انځور 2d).دوه اضافي ډیسلفایډ بانډونه په هیلکس 1′ کې د CXXC موټیف او بل CXXC موټیف تر مینځ رامینځته شوي چې د قبضې په سیمه کې د β-هیرپین په څنډه کې موندل شوي (انځور 2d).یو محافظه کار ارجینین پاتې شوني د نامعلوم فعالیت (Arg37) سره د یو خالي مثلث په دننه کې موقعیت لري چې د 1′، 1، او 2 helices لخوا رامینځته شوی. د الفاټیک کاربن اتومونه Cβ, Cγ، او Cδ Arg37 د هایدروفوبیک کور سره اړیکه لري، او د ګانیډین ګروپونه په سایکل ډول حرکت کوي. د Helices 1′ او 1 تر منځ د Thr32 شاته هډوکي او د غاړې زنځیر (انځور S5a,b) ترمنځ د تعامل له لارې.Tyr34 غار ته غځوي چې دوه کوچني غارونه پریږدي چې له لارې Arg37 کولی شي د محلول سره تعامل وکړي.
Ig-like β-sandwich domains د پروټینونو یوه لویه کورنۍ ده چې د دوه یا ډیرو ملټي سټرینډډ amphipathic β-sheets مشترکه ځانګړتیا د هایدروفوبیک کور 39 له لارې تعامل کوي. او د دوو طبقو څخه جوړ دی (انځور. S6a).شیټ 1 د څلورو تارونو β-پاڼه ده (ډ، F، H، او I) چیرې چې سټینډونه F، H، او I د موازي ضد ترتیب جوړوي، او د I او D تارونه موازي تعامل کوي.جدول 2 یو کوچنی انټي موازي دوه اړخیزه بیټا شیټ دی (ډنډونه E او G).یو داخلي ډیسلفایډ بانډ د E زنځیر د C-ټرمینس او ​​د H چینې مرکز (Cys170-Cys226) (انځور S6b) ترمینځ لیدل شوی.دا ډیسلفایډ بانډ د امیونوګلوبولین 40,41 β-سینڈوچ ډومین کې د ډیسلفایډ بانډ سره ورته دی.
د څلور سټنډ β-شیټ د خپل ټول اوږدوالی په اوږدو کې وګرځي، غیر متناسب کنډکونه جوړوي چې په شکل او الیکټروسټاټیک کې توپیر لري.پتلی څنډه یو فلیټ هایدروفوبیک چاپیریال سطحه ده چې په SPACA6 (انځور S6b,c) کې د پاتې غیر مساوي او الیکټروسټاټیکي متنوع سطحو په پرتله غوره ده.د افشا شوي شاته هډوکي کاربونیل/امینو ګروپونو او د قطبي اړخ زنځیرونو یوه هاله د هایدروفوبیک سطح شاوخوا چاپېره ده (انځور S6c).پراخه حاشیه د پوښ شوي هیلیکل برخې لخوا پوښل شوې چې د هایدروفوبیک کور N-ټرمینل برخه بندوي او د F چینې شاکبون (انځور S6d) د خلاص قطبي ګروپ سره درې هایدروجن بانډونه جوړوي.د دې څنډې C-ټرمینل برخه یو لوی جیب جوړوي چې د جزوی ډول افشا شوي هایدروفوبیک کور سره.جیب د دوه ګونی ارجینین پاتې شونو درې سیټونو (Arg162-Arg221، Arg201-Arg205 او Arg212-Arg214) او یو مرکزي هسټیډین (His220) (شکل S6e) له امله د مثبت چارجونو لخوا محاصره شوی.
د قبضې سیمه د هیلیکل ډومین او د Ig په څیر ډومین تر مینځ یوه لنډه برخه ده چې د یو انټي پارالل درې سټرنډ β-پرت (strands A, B او C)، یو کوچنی 310 هیلیکس، او څو اوږدې تصادفي هیلیلیک برخې لري.(انځور. S7).د قبضې په سیمه کې د covalent او electrostatic تماسونو یوه شبکه داسې ښکاري چې د 4HB او Ig-like ډومین ترمنځ سمت ثبات ټینګ کړي.شبکه په دریو برخو ویشل کیدی شي.په لومړۍ برخه کې دوه CXXC شکلونه شامل دي (27CXXC30 او 139CXXC142) چې د ډیسلفایډ بانډونو یوه جوړه په هینګ کې د β-هیرپین او په 4HB کې د 1′ هیلکس ترمنځ جوړوي.په دویمه برخه کې د Ig-like domain او hinge ترمنځ electrostatic تعاملات شامل دي.په قبضه کې Glu132 د Ig په څیر په ډومین کې د Arg233 سره او په قبضه کې Arg135 سره د مالګې پل جوړوي.په دریمه برخه کې د Ig-like ډومین او د قبضې سیمې تر مینځ یو covalent بانډ شامل دی.دوه ډیسلفایډ بانډونه (Cys124-Cys147 او Cys128-Cys153) د هینګ لوپ له یو لینکر سره وصل کوي چې د Gln131 او شاته هډوکي فعال ګروپ ترمینځ د الکتروسټټیک تعاملاتو لخوا ثبات کیږي، د لومړي Ig په څیر ډومین ته د لاسرسي اجازه ورکوي.زنځیر
د SPACA6 ectodomain جوړښت او د 4HB او Ig په څیر ډومینونو انفرادي جوړښتونه د پروټین ډیټابیس 42 کې د ساختماني ورته ریکارډونو لټون لپاره کارول شوي.موږ میچونه د لوړ ډیلي Z نمرو، کوچني معیاري انحرافاتو، او لوی LALI نمرو سره پیژندلي (وروستی د ساختماني مساوي پاتې شونو شمیر دی).پداسې حال کې چې د بشپړ ایکټوډومین لټون (جدول S1) څخه لومړني 10 هیټونه د 842> 842 د منلو وړ Z-سکور درلود، یوازې د 4HB یا Ig-like ډومین لپاره لټون وښودله چې ډیری دا بریالیتوبونه یوازې د β-سینڈوچ سره مطابقت لري.یو هر اړخیز پوښ په ډیری پروټینونو کې موندل کیږي.په ډیلي کې ټولې درې لټونونه یوازې یوه پایله راوتلې: IZUMO1.
دا د اوږدې مودې لپاره وړاندیز شوی چې SPACA6 او IZUMO1 جوړښتي ورته والی لري 7,32,37.که څه هم د دې دوه ګیمټ فیوژن سره تړلي پروټینونو اکټوډومین یوازې 21٪ ترتیب پیژندنه (شکل S8a) شریکوي، پیچلي شواهد، په شمول د محافظت شوي ډیسلفایډ بانډ نمونه او په SPACA6 کې د C-ټرمینل Ig په څیر وړاندوینه شوې ډومین، د جوړولو لپاره لومړنیو هڅو ته اجازه ورکړه. د A SPACA6 موږک د هومولوژي ماډل IZUMO1 د یوې نمونې په توګه کاروي37.زموږ جوړښت دا وړاندوینې تاییدوي او د ورته والي ریښتیني درجه ښیې.په حقیقت کې، SPACA6 او IZUMO137,43,44 جوړښتونه ورته دوه ډومین جوړښت (انځور. S8b) د ورته 4HB او Ig په څیر β-سندویچ ډومینونو سره شریکوي چې د قبضې سیمې (انځور S8c) لخوا وصل شوي.
IZUMO1 او SPACA6 4HB د دودیز سرپل بنډلونو څخه عام توپیرونه لري.عادي 4HBs، لکه د SNARE پروټین کمپلیکسونو کې موندل شوي چې د Endosomal fusion 45,46 کې شامل دي، په مساوي ډول فاصله شوي هیلیسونه لري چې د مرکزي محور 47 په شاوخوا کې دوامداره منحل ساتي. په مقابل کې، په IZUMO1 او SPACA6 دواړو کې هیلیلیک ډومینونه تحریف شوي، د متغیر منحل او تغیر سره. غیر مساوي بسته کول (شکل S8d).دا ټوټیسټ، شاید د مثلث له امله رامینځته شوی چې د هیلکس 1′، 1 او 2 لخوا رامینځته شوی، په IZUMO1 او SPACA6 کې ساتل کیږي او په helix 1′ کې د ورته CXXC شکل لخوا ثبات لري.په هرصورت، اضافي ډیسلفایډ بانډ چې په SPACA6 کې موندل شوی (Cys41 او Cys55 په ګډه سره د 1 او 2 پورتنۍ هلیکسونه سره نښلوي) د مثلث په سر کې یو ګړندی اپیکس رامینځته کوي ، چې SPACA6 د IZUMO1 په پرتله ډیر متوجه کوي ، د ډیر څرګند غار مثلث سره.برسېره پر دې، IZUMO1 د Arg37 نشتوالی په SPACA6 کې د دې جوف په مرکز کې لیدل شوی.په مقابل کې، IZUMO1 د الیفاټیک او اروماتیک پاتې شونو ډیر عام هایدروفوبیک کور لري.
IZUMO1 د Ig په څیر ډومین لري چې دوه اړخیزه او پنځه سټرنډ شوي β-شیټ43 لري.په IZUMO1 کې اضافي سټنډ په SPACA6 کې کویل ځای په ځای کوي، کوم چې د F strand سره اړیکه لري ترڅو په سټنډ کې د شا هډوکي هایدروجن بانډونه محدود کړي.د پرتله کولو یو په زړه پوری ټکی د دوه پروټینونو د Ig په څیر ډومینونو وړاندوینه شوي سطح چارج دی.د IZUMO1 سطح د SPACA6 سطحې په پرتله ډیر منفي چارج شوی.یو اضافي چارج د C-terminus سره نږدې د سپرم جھلی ته مخامخ دی.په SPACA6 کې، ورته سیمې ډیرې بې طرفه یا مثبت چارج شوي (انځور. S8e).د مثال په توګه، په SPACA6 کې د هایدروفوبیک سطح (پتلې څنډې) او مثبت چارج شوي کندې (پراخې څنډې) په IZUMO1 کې په منفي ډول چارج شوي.
که څه هم د IZUMO1 او SPACA6 ترمنځ اړیکې او ثانوي جوړښت عناصر په ښه توګه ساتل شوي، د Ig په څیر ډومینونو ساختماني سمون وښودله چې دوه ډومینونه د یو بل په پرتله د دوی په عمومي لید کې توپیر لري (انځور S9).د IZUMO1 سرپل بنډل د β-سندویچ په اړه منحل شوی، د مرکزي محور څخه شاوخوا 50° کې مخکې بیان شوي "بومیرنګ" شکل رامینځته کوي.په مقابل کې، په SPACA6 کې هیلیکل بیم په مخالف لوري کې شاوخوا 10 ° ته وخوت.په دې سمتونو کې توپیر ممکن د قبضې په سیمه کې د توپیرونو له امله وي.د ابتدايي ترتیب په کچه، IZUMO1 او SPACA6 د سیستین، ګلیسین، او اسپارټیک اسید پاتې شونو استثنا سره، په کنډک کې لږ ترتیب ورته والی لري.د پایلې په توګه، د هایدروجن بانډونه او الکتروسټیک شبکې په بشپړ ډول توپیر لري.د β-شیټ ثانوي جوړښت عناصر د IZUMO1 او SPACA6 لخوا شریک شوي، که څه هم په IZUMO1 کې زنځیرونه خورا اوږد دي او 310 هیلکس (هیلکس 5) د SPACA6 لپاره ځانګړی دی.دا توپیرونه د دوه نورو ورته پروټینونو لپاره د مختلف ډومین سمتونو پایله لري.
زموږ د ډیلي سرور لټون څرګنده کړه چې SPACA6 او IZUMO1 یوازینۍ دوه تجربه شوي جوړښتونه دي چې د پروټین ډیټابیس کې زیرمه شوي چې دا ځانګړي 4HB فولډ لري (جدول S1).په دې وروستیو کې، DeepMind (Alphabet/Google) الفا فولډ، د عصبي شبکې پر بنسټ سیسټم رامینځته کړی چې کولی شي د لومړنیو ترتیبونو څخه د پروټینونو 3D جوړښتونو په سمه توګه وړاندوینه وکړي.لږ وروسته وروسته له دې چې موږ د SPACA6 جوړښت حل کړ، د الفا فولډ ډیټابیس خپور شو، د وړاندوینې جوړښت ماډلونه چمتو کوي چې د انسان پروټوم 48,49 کې د ټولو پروټینونو 98.5٪ پوښي.زموږ د حل شوي SPACA6 جوړښت د لټون ماډل په توګه کارول، د الفا فولډ انسان پروټوم کې د ماډل لپاره د ساختماني هومولوژي لټون د SPACA6 او IZUMO1 سره ممکنه جوړښتي ورته والی درلودونکي نوماندان پیژندلي.د SPACA6 (انځور S10a) وړاندوینې کې د الفا فولډ د نه منلو وړ دقت په پام کې نیولو سره - په ځانګړي توګه زموږ د حل شوي جوړښت (انځور S10b) په پرتله د 1.1 Å rms ایکټوډومین - موږ ډاډه یو چې د SPACA6 پیژندل شوي میچونه احتمال لري دقیق وي.
مخکې، PSI-BLAST د دریو نورو سپرم پورې تړلي پروټینونو سره د IZUMO1 کلستر لټون کاوه: IZUMO2، IZUMO3، او IZUMO450.الفا فولډ وړاندوینه کړې چې دا د IZUMO کورنۍ پروټینونه د 4HB ډومین ته د ورته ډیسلفایډ بانډ نمونې سره د IZUMO1 (شکل 3a او S11) سره پوښل کیږي ، که څه هم دوی د Ig په څیر ډومین نلري.داسې انګیرل کیږي چې IZUMO2 او IZUMO3 د IZUMO1 په څیر یو طرفه جھلی پروټینونه دي، پداسې حال کې چې IZUMO4 داسې ښکاري چې پټ شوي وي.په ګیمیټ فیوژن کې د IZUMO 2، 3، او 4 پروټینونو دندې ندي ټاکل شوي.IZUMO3 پیژندل کیږي چې د سپرماتوزوا پراختیا په جریان کې د اکروسوم بایوجنسیز کې رول لوبوي51، او د IZUMO پروټین یو پیچلي 50 جوړوي.د IZUMO پروټینونو ساتنه په تی لرونکو حیواناتو، ریټیلیز، او amphibians کې وړاندیز کوي چې د دوی احتمالي فعالیت د نورو پیژندل شوي ګیمیټ فیوژن سره تړلي پروټینونو سره مطابقت لري، لکه DCST1/2، SOF1، او FIMP.
د IST عالي کورنۍ د ډومین جوړښت ډیاګرام ، په ترتیب سره په نارنجي ، شنه او نیلي کې روښانه شوي د 4HB ، هینج ، او Ig په څیر ډومینونو سره.IZUMO4 یو ځانګړی C-ټرمینل سیمه لري چې تور ښکاري.تایید شوي او د ډیسلفایډ بانډونه په ترتیب سره د جامد او نقطو لینونو لخوا ښودل شوي.b IZUMO1 (PDB: 5F4E)، SPACA6، IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1)، IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1)، IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLEMF9)، او AlphaFold DB DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) په ورته رنګ کې د پینل A په څیر ښودل شوي. ډیسلفایډ بانډونه په میګینټا کې ښودل شوي.TMEM95، IZUMO2 او IZUMO3 ټرانس میمبرین هیلسونه ندي ښودل شوي.
د IZUMO پروټین برعکس، د SPACA نور پروټینونه (د بیلګې په توګه، SPACA1، SPACA3، SPACA4، SPACA5، او SPACA9) فکر کیږي چې د SPACA6 (انځور S12) څخه په جوړښت کې توپیر لري.یوازې SPACA9 4HB لري، مګر دا تمه نه کیږي چې ورته موازي ضد موازي یا ورته ډیسلفایډ بانډ د SPACA6 په څیر وي.یوازې SPACA1 ورته د Ig په څیر ډومین لري.الفا فولډ وړاندوینه کوي چې SPACA3، SPACA4 او SPACA5 د SPACA6 په پرتله په بشپړ ډول توپیر لري.په زړه پورې خبره دا ده چې SPACA4 په القاح کې د رول لوبولو لپاره هم پیژندل کیږي، مګر د SPACA6 په پرتله تر ډیره حده، د سپرم او oocyte zona pellucida52 ترمنځ تعامل اسانه کوي.
زموږ د الفا فولډ لټون د IZUMO1 او SPACA6 4HB، TMEM95 لپاره بله لوبه وموندله.TMEM95، یو واحد سپرم ځانګړی ټرانس میمبرین پروټین دی، کله چې 32,33 کم شي نارینه موږکان بانجھ کوي.سپرماتوزوا د TMEM95 نشتوالی نورمال مورفولوژي، حرکت، او د زونا پیلوسیدا ته د ننوتلو وړتیا درلوده او د هګۍ جھلی سره تړلی و، مګر د oocyte جھلی سره یوځای نشو کولی.پخوانیو څیړنو ښودلې چې TMEM95 د IZUMO133 سره جوړښتي ورته والی لري.په حقیقت کې، د الفا فولډ ماډل تایید کړه چې TMEM95 یو 4HB دی چې ورته جوړه CXXC شکلونه د IZUMO1 او SPACA6 په څیر دي او ورته اضافي ډیسلفایډ بانډ د هیلیس 1 او 2 ترمنځ په SPACA6 کې موندل شوي (انځور 3a او S11).که څه هم TMEM95 د Ig په څیر ډومین نلري، دا د SPACA6 او IZUMO1 قبضې سیمو ته ورته د ډیسلفایډ بانډ نمونه لري (انځور 3b).د دې نسخې د خپرولو په وخت کې، د پری چاپ سرور د TMEM95 جوړښت راپور ورکړ، د الفا فولډ 53 پایله تایید کړه.TMEM95 د SPACA6 او IZUMO1 سره ډیر ورته دی او په تکامل ډول دمخه په امفیبینونو کې ساتل شوی (انځور 4 او S13).
د PSI-BLAST لټون د NCBI SPACA6، IZUMO1-4، TMEM95، DCST1، DCST2، FIMP، او SOF1 ډیټابیسونه کارولي ترڅو د ژوند په ونه کې د دې ترتیبونو موقعیت مشخص کړي.د څانګو پوائنټونو تر مینځ فاصله په پیمانه نه ښودل کیږي.
د SPACA6 او IZUMO1 ترمنځ د پام وړ ټولیز جوړښتي ورته والی دا په ګوته کوي چې دوی د محافظت شوي ساختماني عالي کورنۍ بنسټ ایښودونکي غړي دي چې پکې TMEM95 او IZUMO 2، 3، او 4 پروټینونه شامل دي.پیژندل شوي غړي: IZUMO1، SPACA6 او TMEM95.ځکه چې یوازې یو څو غړي د Ig په څیر ډومینونه لري، د IST عالي کورنۍ نښه 4HB ډومین دی، کوم چې د دې ټولو پروټینونو لپاره ځانګړي ځانګړتیاوې لري: 1) د 4HB کویل شوي هیلیس سره د موازي ضد / موازي بدیل سره ترتیب شوي (انځور . 5a)، 2) بنډل یو مثلثي مخ لري چې د بنډل دننه دوه هیلکسونه لري او دریم عمودی هیلکس (انځور. کلیدي ساحه (انځور 5c)) د CXXC شکل، چې د تیوروډوکسین په څیر پروټینونو کې موندل کیږي، د فعالیت لپاره پیژندل کیږي. د redox سینسر 54,55,56 په توګه، په داسې حال کې چې د IST د کورنۍ غړو کې موټیف د پروټین ډیسلفایډ اسومیریزونو سره تړاو لري لکه ERp57 په ګیمیټ فیوژن کې رولونه 57,58 پورې تړاو لري.
د IST عالي کورنۍ غړي د 4HB ډومین د دریو ځانګړتیاو له مخې تعریف شوي: څلور هیلیکونه د موازي او متوازي متقابل لوري تر مینځ بدیل، د با-مثلث هیلیلیک بنډل مخونه، او د وړو مالیکولونو تر منځ د ca CXXC ډبل شکل جوړ شوی.) N-ټرمینل هیلکس (نارنج) او د قبضې سیمه β-ویښتان (شنه).
د SPACA6 او IZUMO1 ترمنځ ورته والی ته په پام سره، د پخوانیو وړتیا د IZUMO1 یا JUNO سره تړلې ازموینه شوې.Biolayer interferometry (BLI) د کاینټیک پر بنسټ د پابند کولو میتود دی چې مخکې د IZUMO1 او JUNO ترمنځ د تعامل اندازه کولو لپاره کارول کیده.د بایوټین لیبل شوي سینسر د IZUMO1 سره د یو بیت په توګه د JUNO شنونکي د لوړ غلظت سره د انکیوبیشن وروسته ، یو قوي سیګنال کشف شو (انځور S14a) ، د سینسر ټیپ سره د بایو میټریل ضخامت کې د پابندۍ هڅول شوي بدلون په ګوته کوي.ورته سیګنالونه (د بیلګې په توګه، JUNO د IZUMO1 شنونکي په وړاندې د بیت په توګه سینسر سره یوځای شوی) (انځور. S14b).هیڅ سیګنال ونه موندل شو کله چې SPACA6 د سینسر پابند IZUMO1 یا سینسر پورې تړلی JUNO (شکل S14a,b) پروړاندې د تحلیل کونکي په توګه کارول شوی و.د دې سیګنال نشتوالی دا په ګوته کوي چې د SPACA6 بهر حجروي ډومین د IZUMO1 یا JUNO د بهر سیلولر ډومین سره اړیکه نه لري.
ځکه چې د BLI ارزونه په بیت پروټین کې د وړیا لیسین پاتې شونو بایوټینیلیشن پراساس ده، دا تعدیل کولی شي د پابندۍ مخه ونیسي که چیرې د لیسین پاتې شونو په تعامل کې ښکیل وي.برسېره پردې، د سینسر په اړه د پابندۍ الرښوونه کولی شي سټیریک خنډونه رامینځته کړي، نو د بیا رغونې SPACA6، IZUMO1 او JUNO ectodomains کې دودیز پل-ډاون ارزونه هم ترسره شوي.سره له دې، SPACA6 د هغه په ​​نښه شوي IZUMO1 یا د هغه په ​​نښه شوي JUNO (انځور S14c،d) سره هیڅ ډول تعامل نه دی په ګوته کوي، کوم چې د BLI تجربو کې لیدل شوي سره مطابقت نلري.د مثبت کنټرول په توګه، موږ د JUNO متقابل عمل د هغه IZUMO1 لیبل سره تایید کړ (شکل S14e او S15).
د SPACA6 او IZUMO1 تر منځ د جوړښتي ورته والي سره سره، د JUNO تړلو لپاره د SPACA6 نشتوالی د حیرانتیا خبره نه ده.د انسان IZUMO1 سطحه له 20 څخه ډیر پاتې شنې لري چې د JUNO سره اړیکه لري، په شمول د دریو سیمو څخه د پاتې شونو په شمول (که څه هم ډیری یې د قبضې په سیمه کې موقعیت لري) (انځور S14f).د دې پاتې شونو څخه، یوازې یو په SPACA6 (Glu70) کې ساتل کیږي.په داسې حال کې چې د پاتې شونو ډیری ځایونه خپل اصلي بایو کیمیکل ملکیتونه ساتي، په IZUMO1 کې د Arg160 اړین پاتې شوني په SPACA6 کې د منفي چارج شوي Asp148 لخوا بدل شوي؛پخوانیو څیړنو ښودلې چې په IZUMO1 کې د Arg160Glu بدلون تقریبا په بشپړ ډول د JUNO43 پابندۍ له مینځه وړي.برسېره پر دې، د IZUMO1 او SPACA6 تر منځ د ډومین سمت کې توپیر د پام وړ د SPACA6 (انځور S14g) په مساوي سیمه کې د JUNO- پابند سایټ د سطحې ساحه د پام وړ زیاته کړه.
د ګیمیټ فیوژن لپاره SPACA6 ته د پیژندل شوي اړتیا سره سره او د IZUMO1 سره ورته والی ، SPACA6 داسې نه بریښي چې د JUNO پابند فعالیت ولري.له همدې امله، موږ هڅه کړې چې خپل جوړښتي معلومات د ارتقاء بیولوژي لخوا چمتو شوي اهمیت سره یوځای کړو.د SPACA6 هومولوګونو ترتیب ترتیب د تی لرونکو حیواناتو هاخوا د ګډ جوړښت ساتنه ښیې.د مثال په توګه، د سیستین پاتې شونه حتی په لرې پورې اړونده امفیبینونو کې شتون لري (انځور 6a).د ConSurf سرور په کارولو سره، د 66 ترتیبونو ډیری ترتیب ترتیب ساتلو ډاټا د SPACA6 سطح ته نقشه شوې.دا ډول تحلیل کولی شي وښيي چې کوم پاتې پاتې شوي د پروټین د تکامل په جریان کې ساتل شوي او کولی شي په ګوته کړي چې کوم سطحي سیمې په فعالیت کې رول لوبوي.
د CLUSTAL OMEGA په کارولو سره د 12 مختلف ډولونو څخه د SPACA6 ایکټوډومینونو ترتیب ترتیب.د ConSurf تحلیل له مخې، ډیری محافظه کار پوستونه په نیلي نښه شوي.د سیستین پاتې شونه په سور رنګ کې روښانه شوي.د ډومین حدود او د ثانوي جوړښت عناصر د سیده په پورتنۍ برخه کې ښودل شوي، چیرته چې تیرونه β-strands او څپې د هیلکسونو نښه کوي.د NCBI لاسرسي پیژندونکي چې ترتیبونه لري عبارت دي له: انسان (Homo sapiens, NP_001303901)، مانډریل (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277)، capuchin بندر (Cebus mimic, XP_0173599, XP_0173599, ca20360001)، cabus monkey (XP_01735996)، ca20360606000000000000000000002001 ویل ( Orcinus orca3_23 XP_032_034 ) .)، پسونه (Ovis aries، XP_014955560)، هاتین (Loxodonta africana, XP_010585293)، سپی (Canis lupus familyis, XP_025277208)، موږک (Mus musculus, NP_001155560)، ټیپ_001555638 611، XP_0318، Platypus، 8) ، 61_89 او Bullfrog (Bufo bufo، XP_040282113).شمیره د انساني نظم پر بنسټ والړ ده.b د SPACA6 جوړښت سطحي نمایندګي د 4HB سره په پورتنۍ برخه کې او د Ig په څیر ډومین په ښکته کې، رنګونه د ConSurf سرور څخه د ساتنې اټکلونو پراساس.غوره ساتل شوي برخې په نیلي رنګ کې دي، په منځنۍ توګه ساتل شوي برخې سپینې دي، او لږ تر لږه ساتل شوي په ژیړ کې دي.ارغواني سیستیند سطحې درې پیچونه چې د لوړې کچې محافظت ښیي په انسیټ لیبل شوي پیچ 1، 2 او 3 کې ښودل شوي. د 4HB کارټون په پورتنۍ ښۍ خوا کې په انسیټ کې ښودل شوی (د ورته رنګ سکیم).
د SPACA6 جوړښت درې لوړ ساتل شوي سطحې سیمې لري (شکل 6b).پیچ 1 د 4HB او د قبضې ساحه پراخه کوي او دوه ساتل شوي CXXC ډیسلفایډ پلونه لري، یو Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 هینج شبکه (انځور. S7)، او درې ساتل شوي خارجي اروماتیک پاتې شوي (Phe31, Tyr137, Phe31)د Ig په څیر ډومین (انځور S6e) پراخه رم، کوم چې د سپرم په سطحه د څو مثبت چارج شوي پاتې شونو استازیتوب کوي.په زړه پورې خبره دا ده چې دا پیچ د انټي باډي اپیټوپ لري چې دمخه ښودل شوي چې د SPACA6 30 فعالیت سره مداخله وکړي.سیمه 3 د Ig په څیر ډومین کې د قبضې او یو اړخ سره پراخه ده؛پدې سیمه کې محافظت شوي پرولینونه (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) او بهر ته مخامخ قطبي / چارج شوي پاتې شونه شامل دي.په حیرانتیا سره، د 4HB په سطحه ډیری پاتې شونه خورا متغیر دي (انځور 6b)، که څه هم فولډ د SPACA6 هومولوګ په اوږدو کې ساتل کیږي (لکه څنګه چې د هایدروفوبیک بنډل کور محافظه کار لخوا اشاره شوې) او د IST عالي کورنۍ هاخوا.
که څه هم دا په SPACA6 کې ترټولو کوچنۍ سیمه ده چې د لږو کشف کولو وړ ثانوي جوړښت عناصرو سره، ډیری د قبضې سیمې پاتې شوني (د سیمې 3 په شمول) د SPACA6 هومولوګونو کې خورا خوندي دي، کوم چې ښایي د هیلیکل بنډل او β-سندویچ سمت رول لوبوي.د محافظه کار په توګه.په هرصورت، د SPACA6 او IZUMO1 د قبضې په سیمه کې د پراخ هایدروجن بانډنګ او الیکټروسټاټیک شبکې سره سره، د داخلي انعطاف ثبوت د IZUMO137,43,44 ډیری اجازه شوي جوړښتونو په ترتیب کې لیدل کیدی شي.د انفرادي ډومینونو ترتیب په ښه توګه سره یوځای شوی، مګر د یو بل سره د ډومینونو موقعیت د مرکزي محور څخه د 50° څخه تر 70° پورې توپیر لري (انځور S16).په حل کې د SPACA6 ساختماني تحرک د پوهیدو لپاره، د SAXS تجربې ترسره شوې (انځور. S17a،b).د SPACA6 ایکټوډومین ابتکار بیا رغونه د راډ کرسټال جوړښت سره سمون لري (انځور S18)، که څه هم د کراتکي پلاټ یو څه انعطاف ښودلی (انځر S17b).دا جوړښت د IZUMO1 سره په تضاد کې دی، په کوم کې چې غیر محدود پروټین دواړه په جال او محلول کې د بومرینګ بڼه غوره کوي.
په ځانګړې توګه د انعطاف وړ سیمې پیژندلو لپاره، د هایدروجن - ډیوټریم تبادلې ډله ایز سپیکٹروسکوپي (H-DXMS) په SPACA6 کې ترسره شوی او د IZUMO143 (انځور 7a،b) په اړه مخکې ترلاسه شوي معلوماتو سره پرتله شوی.SPACA6 په ښکاره ډول د IZUMO1 په پرتله ډیر انعطاف منونکی دی، لکه څنګه چې د 100,000 s تبادلې وروسته په ټول جوړښت کې د لوړ ډیوټریم تبادلې لخوا اشاره شوې.په دواړو جوړښتونو کې، د قبضې سیمې C-ټرمینل برخه د تبادلې لوړه کچه ښیې، کوم چې ممکن د یو بل په پرتله د 4HB او Ig په څیر ډومینونو محدود گردش ته اجازه ورکړي.په زړه پورې خبره دا ده چې د SPACA6 قبضې C-ټرمینل برخه چې د 147CDLPLDCP154 پاتې شونو څخه جوړه ده، یوه ډیره ساتل شوې سیمه ده 3 (انځور 6b)، په احتمالي توګه دا په ګوته کوي چې د انټرډومین انعطاف پذیري د SPACA6 په ارتقاء کې ساتل شوې ځانګړتیا ده.د انعطاف شننې له مخې، د CD حرارتي خټکي ډاټا ښودلې چې SPACA6 (Tm = 51.2 °C) د IZUMO1 (Tm = 62.9 °C) (انځور S1e او S19) په پرتله لږ ثبات لري.
د SPACA6 او ب IZUMO1 H-DXMS انځورونه.د ډیوټریم تبادله سلنه په ټاکل شوي وخت کې ټاکل شوې.د هایدروجن - ډیوټریم تبادلې کچه د رنګ په واسطه په تدریجي پیمانه له نیلي (10٪) څخه تر سور (90٪) پورې ښودل کیږي.تور بکسونه د لوړ تبادلې ساحې استازیتوب کوي.د 4HB، hinge او Ig-like ډومین حدود په کرسټال جوړښت کې لیدل شوي د لومړني ترتیب څخه پورته ښودل شوي.د Deuterium د تبادلې کچه په 10 s, 1000 s, او 100,000 s کې د SPACA6 او IZUMO1 په شفاف مالیکولر سطحونو باندې د پټو چارټ کې پلټل شوي.د ساختمان هغه برخې چې د 50٪ څخه ښکته د ډیوټریم تبادلې کچه لري رنګ سپین دي.د H-DXMS تبادلې 50٪ څخه پورته ساحې په تدریجي پیمانه رنګ شوي.
د CRISPR/Cas9 او د موږک جین ناک آوټ جنیټیک ستراتیژیو کارول د سپرم او هګۍ پابندۍ او فیوژن لپاره د ډیری فکتورونو پیژندلو لامل شوي.د IZUMO1-JUNO او CD9 جوړښت د ښه مشخص تعامل سربیره، ډیری پروټینونه چې د ګیمیټ فیوژن سره تړاو لري په ساختماني او فعاله توګه پټ پاتې کیږي.د SPACA6 بایو فزیک او ساختماني ځانګړتیا د القاح په جریان کې د اډیشن/فیوژن مالیکولر پزل بله برخه ده.
SPACA6 او د IST عالي کورنۍ نور غړي داسې ښکاري چې په تی لرونکو حیواناتو او همدارنګه په انفرادي مرغیو، حشراتو او امفیبیانو کې خورا خوندي دي.په حقیقت کې، داسې انګیرل کیږي چې SPACA6 حتی په زیبرا فش 59 کې د القاح کولو لپاره اړین دی. دا ویش د نورو پیژندل شوي ګیمیټ فیوژن سره تړلی پروټینونو سره ورته دی لکه DCST134، DCST234، FIMP31، او SOF132، وړاندیز کوي چې دا فکتورونه د HAP2 کمښت (هم) د GCS1 په نوم پیژندل شوي پروټینونه چې د ډیری پروټیسټانو د کتلیتیک فعالیت لپاره مسؤل دي.نباتات، او ارتروپډونه.د القاح شوي فیوژن پروټینونه 60, 61. سره له دې چې د SPACA6 او IZUMO1 تر منځ قوي جوړښتي ورته والی شتون لري، د دې پروټینونو د کوډ کولو جینونو د بندیدو په پایله کې په نارینه موږکانو کې د بانجانیت لامل شوی، دا په ګوته کوي چې د ګیمیټ فیوژن کې د دوی دندې نقل شوي ندي..په پراخه توګه، هیڅ یو پیژندل شوی سپرم پروټینونه چې د فیوژن مرحلې لپاره اړین دي بې ځایه ندي.
دا یوه خلاصه پوښتنه پاتې ده چې ایا SPACA6 (او د IST عالي کورنۍ نور غړي) په انټرګامیټیک جنکشن کې برخه اخلي ، د انټراګامیټیک شبکې رامینځته کوي ترڅو مهم پروټینونه د فیوژن پوائنټونو لپاره استخدام کړي ، یا حتی حتی د عصبي فوسوجن په توګه عمل وکړي.د HEK293T حجرو کې د ګډ معافیت مطالعاتو د بشپړ اوږدوالي IZUMO1 او SPACA632 ترمنځ متقابل عمل څرګند کړ.په هرصورت، زموږ بیا جوړونکي اکټوډومین په ویټرو کې متقابل عمل نه دی کړی، وړاندیز کوي چې تعاملات په نودا او ال کې لیدل شوي.دواړه په ساختمان کې حذف شوي (د IZUMO1 سایتوپلاسمیک دم په یاد ولرئ، کوم چې د القاح لپاره غیر ضروري ښودل شوي 62).په بدیل توګه، IZUMO1 او/یا SPACA6 ممکن ځانګړي پابند چاپیریال ته اړتیا ولري چې موږ یې په ویټرو کې بیا تولید نه کوو، لکه د فزیولوژیکي پلوه ځانګړي جوړښتونه یا مالیکولر کمپلیکسونه چې نور پروټینونه لري (پېژندل شوي یا تراوسه ندي موندل شوي).که څه هم IZUMO1 ectodomain په دې باور دی چې د پیرویټیلین ځای کې هګۍ ته د سپرماتوزوا ضمیمه کولو منځګړیتوب کوي، د SPACA6 ectodomain موخه څرګنده نه ده.
د SPACA6 جوړښت ډیری ساتل شوي سطحونه څرګندوي چې ممکن د پروټین - پروټین تعامل کې ښکیل وي.د قبضې سیمې ساتل شوې برخه سمدلاسه د CXXC موټیف سره نږدې ده (پورته ټاکل شوی پیچ 1) ډیری بهر ته مخ شوي اروماتیک پاتې شونه لري چې ډیری وختونه د بایو مالیکولونو تر مینځ د هایدروفوبیک او π - سټکینګ تعاملاتو سره تړاو لري.د Ig په څیر ډومین (سیمه 2) پراخ اړخونه د لوړ محافظت شوي ارګ او د هغه د پاتې شونو سره مثبت چارج شوي نالی جوړوي، او د دې سیمې په وړاندې انټي باډي پخوا د ګیمیټ فیوژن 30 بندولو لپاره کارول شوي.انټي باډي 212RIRPQLTHRGTFS225 خطي اپیټوپ پیژني، کوم چې د شپږو ارګینین پاتې شونو څخه درې لري او د His220 ډیر خوندي ساتل کیږي.دا روښانه نده چې ایا دا ناروغي د دې ځانګړي پاتې شونو د بندیدو له امله ده یا ټوله سیمه.د β-سندویچ د C-ټرمینس سره نږدې د دې خلا موقعیت د ګاونډیو سپرم پروټینونو سره د cis تعامل په ګوته کوي، مګر د oocyte پروټینونو سره نه.برسېره پردې، په قبضه کې د خورا انعطاف وړ پرولین بډایه ټنګ (سایټ 3) ساتل ممکن د پروټین - پروټین تعامل ځای وي یا په ډیر احتمال سره د دوه ډومینونو ترمینځ د انعطاف ساتل په ګوته کړي.جندر د SPACA6 د نامعلوم رول لپاره مهم دی.د gametes فیوژن.
SPACA6 د انټر سیلولر اډیشن پروټین ځانګړتیاوې لري، په شمول د Ig-like β-sandwiches.ډیری چپکونکي پروټینونه (د بیلګې په توګه، کیډیرینز، انټیګرینز، اډیسینز، او IZUMO1) یو یا څو β-سندویچ ډومینونه لري چې پروټینونه د حجرو غشا څخه د دوی چاپیریال اهدافو ته غزوي 63,64,65.د SPACA6 د Ig په څیر ډومین هم یو موټیف لري چې په عام ډول د β-سندویچونو د چپکولو او همغږۍ په برخه کې موندل کیږي: د β-سینڈوچ په پای کې د موازي تارونو ډبلونه چې د میخانیکي کلیمپ په نوم پیژندل کیږي.داسې انګیرل کیږي چې دا شکل د شین ځواکونو مقاومت زیاتوي، کوم چې د انټر سیلولر تعاملاتو کې دخیل پروټینونو لپاره ارزښت لري.په هرصورت، د اډیسینونو سره د دې ورته ورته والي سره سره، اوس مهال داسې شواهد شتون نلري چې SPACA6 د هګۍ سپینو سره اړیکه لري.د SPACA6 ایکټوډومین نشي کولی JUNO سره وصل شي، او د SPACA6 څرګندونکي HEK293T حجرې، لکه څنګه چې دلته ښودل شوي، په سختۍ سره د زونا 32 نشتوالي oocytes سره اړیکه لري.که چیرې SPACA6 انټرګامیټیک بانډونه رامینځته کړي، دا تعامل ممکن د ژباړې وروسته تعدیلاتو یا د نورو سپرم پروټینونو لخوا ثبات ته اړتیا ولري.د وروستنۍ فرضیې په ملاتړ کې، د IZUMO1 نیمګړتیا سپرماتوزا په oocytes پورې تړلې ده، دا په ډاګه کوي چې د IZUMO1 پرته نور مالیکولونه د 27 ګیمټ اډیشن مرحله کې ښکیل دي.
ډیری ویروسي، سیلولر، او پرمختیایي فیوژن پروټینونه ځانګړتیاوې لري چې د فیوزوجن په توګه د دوی فعالیت اټکل کوي.د مثال په توګه، ویروس فیوژن ګلیکوپروټینونه (د I, II او III ټولګي) د پروټین په پای کې هایدروفوبیک فیوژن پیپټایډ یا لوپ لري چې د کوربه غشا ته داخلیږي.د IZUMO143 د هایدروفوبیک نقشه او جوړښت (ټاکل شوی او وړاندوینه شوی) د IST عالي کورنۍ هیڅ څرګند هایدروفوبیک فیوژن پیپټایډ ندی ښودلی.په دې توګه، که چیرې په IST کې کوم پروټینونه د فوسوجن په توګه کار وکړي، نو دوی دا کار د نورو پیژندل شویو مثالونو څخه توپیر لري.
په پایله کې، د IST عالي کورنۍ د پروټینونو د غړو دندې چې د ګیمیټ فیوژن سره تړاو لري یو زړه راښکونکی راز پاتې دی.زموږ ځانګړی شوی SPACA6 بیا جوړونکی مالیکول او د هغې حل شوی جوړښت به د دې ګډ جوړښتونو ترمینځ اړیکو او د ګیمیټ ضمیمه او فیوژن کې د دوی رول ته بصیرت چمتو کړي.
د DNA ترتیب د وړاندوینې شوي انساني SPACA6 ایکټوډومین سره مطابقت لري (NCBI د لاسرسي شمیره NP_001303901.1؛ پاتې شونه 27-246) د ډروسوفیلا میلانوګاسټر S2 حجرو کې د څرګندولو لپاره کوډون مطلوب و او د جینس کوفینس انکوزامینیک سره ترکیب شوی.، د BiP سیګنال او اړونده 5′ او 3′ د دې جین د ligation-خپلواک کلوننګ لپاره پای ته رسیږي د pMT اظهار ویکتور ته د میټالوتیونین پروموټر پراساس د puromycin (pMT-puro) سره د انتخاب لپاره تعدیل شوی.د pMT-puro ویکتور د thrombin cleavage site encodes a 10x-His C-terminal tag (شکل S2).
د D. melanogaster S2 (Gibco) حجرو ته د SPACA6 pMT-puro ویکتور ثابت لیږد د پروتوکول په څیر ترسره شو چې د IZUMO1 او JUNO43 لپاره کارول کیږي.د S2 حجرې د شنایډر په متوسطه (Gibco) کې د 10٪ (v/v) د تودوخې غیر فعال شوي جنین خوسکي سیرم (Gibco) او 1X انټي مایکوټیک انټي بیوټیک (Gibco) وروستي غلظت سره ضمیمه شوي او وده شوې.د مخکینۍ تیریدو حجرې (3.0 x 106 حجرې) د 6 څاګانو پلیټونو (کورنینګ) په انفرادي څاګانو کې پلي شوي.د 27 درجې سانتي ګراد په حرارت کې د 24 ساعتونو انکیوبیشن وروسته، حجرې د جوړونکي پروتوکول سره سم د 2 ملی ګرامه SPACA6 pMT-puro ویکتور او Effectene transfection reagent (Qiagen) مخلوط سره لیږدول شوي.انتقال شوي حجرې د 72 ساعتونو لپاره سینګار شوي او بیا د 6 mg/ml puromycin سره راټول شوي.بیا حجرې د شنایډر له بشپړې وسیلې څخه جلا شوې او په سیروم کې د حشراتو-ایکسپریس څخه پاک میډیم (لونزا) کې ځای په ځای شوي ترڅو په لویه کچه پروټین تولید کړي.د S2 حجرو کلتور یوه 1 L ډله په 8-10 × 106 ml-1 حجرو کې په 2 L هوا شوي فلیټ باټم پولی پروپیلین ایرلین مییر فلاسک کې وده کړې او بیا د 500 µM CuSO4 (Millipor Sigma) وروستي غلظت سره تعقیم شوي او جراثیم فلټر شوي.هڅول.هڅول شوي کلتورونه د څلورو ورځو لپاره په 120 rpm کې په 27 درجې سانتي ګراد کې سینګار شوي.
کنډیشن شوی میډیم چې SPACA6 لري د سینټرفیوګیشن لخوا په 5660×g کې په 4°C کې جلا شوی و او ورپسې د سینټرمیټ tangential جریان فلټریشن سیسټم (Pall Corp) د 10 kDa MWCO جھلی سره.متمرکزه متوسطه چې SPACA6 لري په 2 ملی لیتر Ni-NTA اګروز رال (کیجین) کالم کې تطبیق کړئ.د Ni-NTA رال د بفر A د 10 کالم حجم (CV) سره مینځل شوی او بیا د بفر A 1 CV اضافه شوی ترڅو د 50 mM وروستی imidazole غلظت ورکړي.SPACA6 د 10 ملی لیتر بفر A سره د امیډازول سره ضمیمه شوی و چې وروستی غلظت یې 500 mM دی.د بندیز طبقې ترومبین (ملی پور سیګما) په مستقیم ډول د ډایلیسس ټیوب (MWCO 12-14 kDa) کې په 1 واحد کې د فی mg SPACA6 په مقابل کې د 1 L 10 mM Tris-HCl، pH 7.5 او 150 mM NaCl (بفر B) لپاره اضافه شوی.د ۴۸ ساعتونو لپاره په ۴ درجو سانتي ګراد کې.ترومبین-کلیوډ SPACA6 بیا د مالګې غلظت کمولو لپاره درې چنده منحل شو او په 1 ملی لیتر MonoS 5/50 GL کیشن ایکسچینج کالم (Cytiva/GE) کې د 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 سره انډول شوی.د کیشن ایکسچینجر د 3 OK 10 mm Tris-HCl، pH 7.5 سره مینځل شوی، بیا SPACA6 د 0 څخه تر 500 mm NaCl کې د 10 mm Tris-HCl، pH 7.5 لپاره د 25 OK لپاره د خطي تدریجي سره مینځل شوی.د آیون تبادلې کروماتګرافي وروسته، SPACA6 په 1 ملی لیتر متمرکز شوی او د بفر B سره انډول شوي د ENrich SEC650 10 x 300 کالم (BioRad) څخه په isocratically eluted. د کروماتګرام له مخې، حوض او متمرکزې برخې چې SPACA6 لري.پاکوالی د 16٪ SDS-polyacrylamide جیل کې د Coomassie-stained electrophoresis لخوا کنټرول شوی و.د پروټین غلظت په 280 nm کې د بییر لامبرټ قانون او تیوریکي مولر د ختمیدو ضمیمه په کارولو سره د جاذبې له لارې اندازه شوی.
پاک شوی SPACA6 د شپې په اوږدو کې د 10 mM سوډیم فاسفیټ، pH 7.4 او 150 mM NaF په مقابل کې ډیل شوی او د CD سپیکٹروسکوپي لخوا تحلیل دمخه 0.16 mg/mL ته کم شوی.د 185 څخه تر 260 nm طول موج سره د CDs سپیکٹرل سکیننګ د Jasco J-1500 spectropolarimeter کې د کوارټز cuvettes په کارولو سره د 1 mm نظری لارې اوږدوالی (Helma) په 25 ° C کې د 50 nm/min په سرعت سره راټول شو.د CD سپیکٹرا اساسی کرښه سمه شوې، په اوسط ډول له 10 څخه زیات استملاک شوي، او د cm2/dmol درجو کې د پاتې کیدو اوږدوالی (θMRE) ته بدل شوي:
چیرته چې MW په Da کې د هرې نمونې مالیکولر وزن دی؛N د امینو اسیدونو شمیر دی؛θ په ملی ګرامو کې بیضاوی دی؛d په سانتي مترو کې د نظری لارې اوږدوالی سره مطابقت لري؛په واحدونو کې د پروټین غلظت.