310 10*1mm سټینلیس سټیل کویل شوي ټیوب کیمیاوي برخه ، د سپیډروین N-ټرمینل ډومینونه د امیلایډ فایبریلونو پراساس هایدروجیل جوړوي او د پروټین متحرک کولو لپاره پلیټ فارم چمتو کوي.

د Nature.com لیدلو لپاره مننه.تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).برسېره پردې، د روان ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کوو.
سلایډونه په هر سلایډ کې درې مقالې ښیې.د هر سلایډ له لارې حرکت کولو لپاره شاته او بل بټن وکاروئ، یا د سلایډ کنټرولر بټن په پای کې د هر سلایډ له لارې حرکت وکړئ.

مشخصات

310 10 * 1mm سټینلیس سټیل کویل شوي ټیوب عرضه کونکي

کیمیاوي جوړښت

میخانیکي ملکیتونه

Recombinant spider silk proteins ( spider silk proteins ) د نوو بایومیټریالونو په پراختیا کې ډیری احتمالي غوښتنلیکونه لري، مګر د دوی ملټي موډل او د مجموعې پلوه طبیعت د دوی ترلاسه کول ستونزمن او کارول یې اسانه کوي.دلته موږ راپور ورکوو چې بیا جوړونکي کوچني سپیډروین پروټینونه او په مهم ډول د N-ټرمینل ډومین (NT) پخپله په چټکۍ سره په 37 ° C کې د ځان ملاتړي او شفاف هایدروجیل جوړوي.فیوژن پروټینونه چې د NT او شنه فلوروسینټ پروټین یا purine nucleoside phosphorylase څخه جوړ دي په بشپړ ډول فعال فیوژن پروټینونه جوړوي.هایدروجیلونه.زموږ پایلې ښیي چې بیا جوړونکي NT او فیوژن پروټینونه لوړ څرګند محصولات چمتو کوي او د زړه راښکونکي ملکیتونو سره هایدروجیلونه ورکوي لکه شفافیت ، پرته له کراس لینک کولو جیلیشن ، او په لوړ کثافت کې د فعال پروټینونو مستقیم حرکت.
مکڑی د ورېښمو غدې اووه مختلفې سیټونه لري چې هر یو یې یو ځانګړی ډول ورېښم تولیدوي.د ورېښمو ټول اوه ډولونه د سپیډر ورېښمو پروټینونو (spidroins) څخه جوړ شوي دي چې شاوخوا 6000 پاتې دي او د کروي N- او C-ټرمینل ډومینونو (NT او CT) 1,2 لخوا محاصره شوي لوی مرکزي تکرار سیمه لري.د ورېښمو تر ټولو پراخه مطالعه شوی ډول، لومړنی امپولا، د لومړني امپولا غدې لخوا تولید شوی.په دې غده کې، د اپیتیلیل حجرو یو مونولیر د سپیډروین پروټینونه ترکیبوي او د غدې په لیمین کې یې پټوي، چیرته چې دوی په خورا لوړ غلظت (30-50٪ w/v) 3,4 کې په محلول شوي شکل (ډوپینګ) کې شتون لري.په غده کې د اصلي امپولر سپیډروین پروټینونو تنظیم او جوړښت په اړه بحث شوی، مګر ډیری تجربوي شواهد په عمومي ډول د هیلیکل او/یا تصادفي هیلیلیک جوړښت او مایکلر یا لامیلر جوړښت 5,6,7,8,9,10 شتون په ګوته کوي.پداسې حال کې چې تکرار شوي ډومینونه د ورېښمو فایبرونو میخانیکي ملکیتونه تنظیموي ، د β-شیټ نانوکریسټالونه او امورفوس جوړښتونه رامینځته کوي 11,12,13,14,15 ، پای ډومینونه د ورېښمو غدې په اوږدو کې د بدلون شرایطو په ځواب کې د ورېښمو فایبر تنظیموي 16,17,18.د ورېښمو جوړښت کنټرولولو سره، 19. ترمینل ډومینونه په تکامل ډول ساتل کیږي او د دوی فعالیت ممکن د ټولو سپیډروین پروټینونو 2,20,21 لپاره عام وي.د غدې له لارې د تېرېدو په وخت کې، د سپیډروین pH له 7.6 څخه تر <5.716 پورې راټیټیږي او په تدریجي ډول د تنګ شوي نالی له لارې د حرکت په واسطه منځګړیتوب د شین او سټرچ سره وده کوي.په حل کې، CT د α-helical جوړښت موازي dimer17 دی، مګر د ټیټ pH او شین قوتونو په ځواب کې، CT β-layers 16، 17 ښکاره کوي او بدلوي، چې ممکن د کنورټ 16 په تکراري سیمو کې β-پرتونه رامینځته کړي. NT د مونومیریک لاندې دي. هغه شرایط چې د غدې په لیمن کې شرایط منعکس کوي او د سپیډروین محلول منځګړیتوب کوي ، مګر د pH په کمیدو سره ، د یو شمیر کاربوکسیلیک اسید اړخ زنځیرونو پروټونیشن د نږدې 6.5 pKa سره د NT ډیمیرائزیشن لامل کیږي ، پدې توګه د NT ثبات کوي او په لویه کچه سپیډروین تنظیموي. مقدارونهشبکې 16,18.په دې توګه، NT د فایبر په جوړښت کې کلیدي رول لوبوي، په کوټ کې د مونومر څخه په فایبر 23,24,25 کې ډیمر ته بدلیږي.NT د 16، 18، 19، 20، 26، 27، 28، 29 نیټې پورې مطالعه شوي ټولو شرایطو کې خورا محلول او هیلیک پاتې کیږي، کوم چې د هیټرولوژس پروټینونو تولید لپاره د محلولیت لوړولو لیبل په توګه د هغې پراختیا هڅولې.
Recombinant مینی سپیډر ورېښمو پروټین، چې یو NT، یو لنډ تکرار سیمه، یو CT، او د پاکولو لپاره د His6 tag (His-NT2RepCT) څخه جوړ دی، په اوبو کې محلول کیږي لکه د اصلي سپیډر ورېښمو پروټین او د ورېښمو د سپینو اصلي ځانګړتیاو سره مطابقت لري. .پوښښ 25.31.His-NT2RepCT د بایومیمیټیک ماشین په کارولو سره په دوامداره فایبرونو کې توزیع کیدی شي په کوم کې چې د pH 8 محلول کوټینګ د pH 525,32,33,34,35 اوبو حمام کې ایستل کیږي.د E. coli د بایوریکټر خمیر کول چې د هغه-NT2RepCT څرګندونه کوي او د درملنې وروسته وروسته د پاکولو وروسته د 14 g/L حاصلاتو پایله درلوده.لوړ حاصل، لوړ محلول، او تیزابي شرایطو ته د His-NT2RepCT مناسب ځواب ټول NT23, 25, 34 ته منسوب شوي.
دلته موږ د 37 سانتي ګراد په حرارت کې د پروټین محلول په مینځلو سره یوازې د NT په شمول د بیا جوړونکي سپیډروین پروټینونو څخه د شفاف هایدروجیل ګړندي رامینځته کیدو راپور ورکوو.د thioflavin T fluorescence (ThT)، د فویریر ټرانسفارم انفراریډ سپیکٹروسکوپي (FTIR)، اټومي مقناطیسي ریزونانس سپیکٹروسکوپي (NMR) او د لیږد الیکټران مایکروسکوپي (TEM) په کارولو سره، موږ وموندله چې NT او مایکرو سپیډر پروټینونه په β-sheets او amyloid-like fibrus کې جوړښتي بدلون څخه تیریږي. کله چې جیلونه جوړ شي.برسېره پردې، د NT او شنه فلوروسینټ پروټین (GFP) یا purine nucleoside phosphorylase (PNP) فیوژن پروټینونه د بشپړ فعال فیوژن ټوټې سره هایدروجیل جوړوي.په هیټرولوژس هسټونو کې د لوړې کچې څرګندونه ، د فیزولوژیکي شرایطو لاندې د هایدروجیلونو ګړندۍ رامینځته کیدو سره ، د انجینر شوي دندو سره د هایدروجیلونو د ارزانه تولید امکان خلاصوي.
د ډیری راپور شوي recombinant spidroin پروټینونو برعکس، His-NT2RepCT په Tris-HCl بفر کې په pH 8 کې ثبات لري او د باران پرته تر 500 mg/mL پورې متمرکز کیدی شي.له همدې امله، موږ حیران شو چې دا پروتین په چټکۍ سره د 37 درجې C (Fig. 1b-d) کې د سینګار کولو په وخت کې په چټکۍ سره د نظري پلوه روښانه، ځان مالتړ کونکي هایدروجیل جوړوي.نورو څیړنو ښودلې چې د His-NT2RepCT جیلیشن په پراخه کچه د پروټین غلظت (10-300 mg/mL) کې رامینځته شوی او دا غلظت د جیلیشن وخت سره په معکوس ډول تړاو درلود (انځور 1c او اضافي شکل 1).د دې موندلو لپاره چې د His-NT2RepCT کومې برخې د هایدروجیل جوړښت منځګړیتوب کوي، موږ بیا هر یو ډومین په انفرادي ډول او په مختلفو ترکیبونو کې د فلاسک انعطاف ارزونې په کارولو سره معاینه کړه (شکل 1a،b).د recombinant spidroin ټولې ازمویل شوي برخې د 1 ساعت څخه په کم وخت کې جیلونه جوړ کړي (د پروټین غلظت په 300 mg/mL کې)، پرته له دې چې د 2Rep (شکل 1b).دا وړاندیز کوي چې NT او CT یوازې، په ترکیب کې، یا د تکرار سره تړاو لري، کولی شي په 37 درجې سانتي ګراد کې جیل شي او د His6 ټاګ په دې پروسه کې د پام وړ حد اغیزه نه کوي.د عام مفکورې په پام کې نیولو سره چې NT خورا محلول شوی او باثباته پروټین دی، او دا چې د بیا جوړونکي سپیډروین هایدروجیل پخوانیو راپورونو په تکرار سیمو او/یا CTs کې د جیلیشن اغیزې رامینځته شوي بدلونونو ته منسوب کړي، NT پخپله کولی شي.د جیلیشن کشف غیر متوقع و.ضمیمه جدول 1) 37, 38, 39. د پام وړ، NT دمخه په 10 دقیقو کې د ≥ 300 mg/mL غلظت (انځور 1c) کې جیل شوی.د NT د مختلف غلظت سره د شیشې انعطاف تجربو وښودله چې په 50 mg/mL کې د NT محلول په ورته غلظت کې د His-NT2RepCT په پرتله ګړندی جیلی شوی (w/v، شکل 1c).
په دې کار کې د مختلف سپیډروین ساختمانونو سکیماتیک استازیتوب مطالعه شوی.b د جیل وخت په 37 °C کې د مختلف بیا جوړونکي سپیډروین پروټینونو لپاره (300 mg/mL) د شیشې په بدلولو سره تایید شوی.CT جیل سمدلاسه پرته له انکیوبیشن (<300 mg/mL)، 2Rep precipitates (300 mg/mL، 5 mm پیمانه).د هز-NT2RepCT او NT د جیل وخت په 37 درجو کې د پروټین غلظت په نښه شوي.د هز-NT2RepCT او NT هایدروجیل عکسونه چې د مکڑی سره او د "NT" لیک لاندې په ترتیب سره چاپ شوی (دواړه 200 mg/mL، د پیمانه بار 5 mm).
هایدروجیلونه چې د مختلف بیا جوړونکي سپیډروین پروټینونو لخوا رامینځته شوي یو څه مختلف رنګونه لري، او د سترګو لیدل د روڼتیا مختلف درجې ښیي (انځور 1b).د NT جیلونه په استثنایی ډول روښانه دي پداسې حال کې چې نور جیلونه ناپاک کیږي.د هز-NT2RepCT او NT جیلونه په سلنډر ټیوبونو کې اچول کیدی شي د مولډ څخه لیرې شي (انځور 1d).
د دې معاینې لپاره چې ایا د طبیعي سپیډر ورېښمو پوښاک جیل په شرایطو کې اوس موندل شوي چې د بیا جوړونکي سپیډروین پروټینونو جیلیشن لامل کیږي ، پوښونه د سویډن برج سپیډر (لارینیوایډس اسکلوپیټیریوس) له لوی امپولا غدې څخه راټول شوي.پوښونه په 20 mM Tris-HCl بفر کې په 50 mg/mL (د اندازه شوي وچ وزن پراساس) کې زیرمه شوي وو، مګر په 37 ° C (اضافي شکل 2a) کې د 21 ورځو انکیوبیشن په جریان کې هیڅ جیلیشن ونه لیدل شو.
د دې جیلونو اندازه کولو لپاره، ریولوژیکي اندازه کول د جیلیشن پروسې مطالعې او ټول میخانیکي ملکیتونو ټاکلو لپاره کارول کیدی شي.په ځانګړې توګه، په لوړه تودوخه کې د ذخیرې موډول (لچکتیا) څارنه کولی شي د جیلینګ تودوخې او همدارنګه د کوټینګ ویسکویلاسټیک ملکیتونو په اړه معلومات چمتو کړي.د تودوخې د زیاتوالي تجربې (د 1°C/min په 25-45°C کې کارول، د پخوانیو مطالعاتو پراساس چې د طبیعي ورېښمو ذخیره حلونو په کارولو سره) 40,41 ښودلې چې د His-NT2RepCT او NT محلولونو ذخیره کولو ماډل د تودوخې په زیاتوالي سره زیات شوی.زیاته شوې وه (انځور 2 او تکمیلی شکل. 3).د پام وړ، د NT ماډل د His-NT2RepCT په پرتله په ټیټ حرارت کې وده پیل کړه، د چټک جیل وخت سره مطابقت لري کله چې NT مستقیم د His-NT2RepCT سره په 37 ° C (شکل 1) کې لیدل شوی و.د تودوخې د یو پرله پسې کمښت وروسته، د ذخیره کولو ماډل بیرته ټیټ ارزښتونو ته نه وګرځید او د ضایع کولو ماډل څخه پورته پاتې شو (اضافی شکل 3 وګورئ)، چې د تودوخې نه بدلیدونکي مستحکم جیلیشن په ګوته کوي.د جیلیشن وروسته، وروستی لچک وړ ماډل د 15 څخه تر 330 kPa پورې د His-NT2RepCT هایدروجیلونو لپاره د 100-500 mg/mL غلظت کې، او د NT هایدروجیلونو لپاره وروستی لچک وړ ماډل (100-500 mg/mL) له 00 څخه تر 2441 پورې. kPa (انځور، 2 او بشپړ ریمپ ډاټا) ضمیمه انځور 3 وګورئ).
د حرارت درجه کې بدلون د اندازه کولو په وخت کې د His-NT2RepCT (300 mg/mL) او b NT (300 mg/mL) د ټکولو سره.تیر د تودوخې رجحان په ګوته کوي ، او د ذخیره کولو ماډل ډیټا روښانه سیوري د تولید کونکي لخوا ټاکل شوي په پرتله د وسیلې لپاره د ټیټ تورک ارزښتونو ازموینه ښیې ، کوم چې د ډیر شور لامل دی.c د لوړې تودوخې (100, 300, او 500 mg/mL) وروسته د His-NT2RepCT او NT پای ماډل جمع کول.ټول ماډل لوستل د 0.1 Hz په فریکونسۍ کې اخیستل کیږي.
د جیلیشن سره تړلي ساختماني بدلونونو څیړلو لپاره د احتمالي میتود په توګه، موږ د 37 ° C (شکل 3a،b) کې د جیلیشن څخه مخکې او وروسته د His-NT2RepCT او NT FTIR سپیکٹرا ثبت کړل.لکه څنګه چې تمه کیده، د His-NT2RepCT او NT محلولونو سپیکٹرا د پروټینونو سره مطابقت لري چې د α-helix/تصادفي کویل ثانوي جوړښت ښیې، په 1645 cm-1 کې د اعلان شوي بانډ سره.د دواړو هایدروجیلونو لپاره، جیلیشن په پایله کې د دوه لاسونو د منځني I band په شاوخوا کې 1617 cm-1 او 1695 cm-1 (انځور 3a, b) رامینځته کیږي، د انټي پارالل β-شیټ جوړښتونو جوړښت په ګوته کوي.دا بدلونونه په اړونده دوهم مشتق او توپیر جیلیشن سپیکٹرا کې هم په واضح ډول لیدل کیدی شي (اضافی شکل. 4b).د NT β-پرت دوه بانډونه د His-NT2RepCT په پرتله ډیر څرګند وو، دا په ګوته کوي چې په NT هایدروجل کې د β-پرت بانډونو ټول مینځپانګه د NT2RepCT هایدروجیل څخه لوړه وه.
د FTIR د جذب سپیکٹرا د His-NT2RepCT او b NT (دواړه 500 mg/mL) مخکې له (حل) او (جیل) انکیوبیشن وروسته په 37 درجې سانتي ګراد کې.c د بیا ځنډول شوي 50 mg/ml NT2RepCT جیلونو او د NT TEM عکسونه.پیمانه بار 200 nm.د His-NT2RepCT او NT هایدروجیلونو فایبر قطر.n = 100 اندازه شوي فایبریلونه، p <0.0001.د خطا بارونه معیاري انحراف ښیې.د خطا بارونو مرکز منځنی دی.د احصایوي تحلیل لپاره یو نه جوړ شوی ټ-ټیسټ (دوه پایه) کارول شوی و.f په 37 °C کې د مختلف بیا جوړونکي سپیډروین پروټینونو ThT فلوروسینس (100 mg/mL) پرته له ټکولو.g NT (100 mg/mL) د 100 mg/mL NT جیل څخه د 0٪، 5٪، 10٪، او 20٪ تخمونو سره د واکسین تجربه.
د لیږد الکترون مایکروسکوپي (TEM) په کارولو سره د جیل تحلیل وښودله چې هایدروجیل د امیلایډ په څیر فایبریلونه لري (انځر 3c, 3d).د NT جوړ شوي فایبریلونه اوږده شوي (5-12 nm قطر کې) او بې شاخه وو، پداسې حال کې چې د His-NT2RepCT فایبریلونه په اوږدوالي کې لنډ او په قطر کې د پام وړ پراخ وو (7-16 nm) (انځور 3e).دې پایلو موږ ته اجازه راکړه چې د تیوفلاوین T (ThT) ارزونې په کارولو سره د فایبرروسس کایناتیک تعقیب کړو.د ټولو recombinant spidroin پروټینونو لپاره، د فلوروسینټ سیګنال زیات شو کله چې نمونې په 37 ° C (انځور 3f، ضمیمه انځور. 5a).د دې موندنو سره په مطابقت کې، د NT او His-NT2RepCT مایکروسکوپیک معاینه د جیلینګ شرایطو لاندې د ThT فلوروسینس کې یونیفورم زیاتوالی د ThT-مثبت مجموعو د پام وړ ځایی جمع کولو پرته ښکاره شو (اضافی شکل. 5b,c).د ThT-مثبت فایبریلونو جوړښت د NT او His-NTCT turbidity (اضافی شکل 5d) له زیاتوالي سره نه و، دا پدې مانا ده چې په جیل کې د فایبریلونو شبکه کولی شي پرته له دې چې د جیل وضاحت سره موافقت وکړي.د لږ مقدار دمخه جوړ شوي فایبریلونو په اضافه کولو سره تخم کرل کولی شي د ځینې امیلایډز 42,43,44 فایبریل جوړښت ګړندی کړي مګر د NT هایدروکوګولینټ محلول کې 5٪، 10٪ یا 20٪ (w/w) NT اضافه کړي.د تخم کولو اغیز (3g انځور).شاید دا د دې حقیقت له امله وي چې په هایدروجیل کې فایبریلونه نسبتا ثابت دي او د تخمونو په توګه نشي کارول کیدی.
په لوړه تودوخه کې د بیا جوړونکي سپیډروین پروټینونو غیر متوقع چلند نور اټومي مقناطیسي ریزونانس (NMR) سپیکٹروسکوپي مطالعې هڅولې ترڅو د جیل جوړښت سره تړلي بدلونونه وپیژني.د His-NT2RepCT حلونو NMR سپیکٹرا د وخت په تیریدو سره په 37 °C کې ثبت شوي وښودله چې CT لاهم په جزوي ډول پوښل شوی و، پداسې حال کې چې د NT او 2Rep سیګنالونه ورک شوي وو (انځور 4a)، دا وړاندیز کوي چې دا په عمده توګه NT او 2Rep و چې په جزوي توګه د His-Control جوړښت کنټرولوي. NT2RepCT هایدروجیل.د CT سیګنال هم د خپل اصلي شدت 20٪ ته کم شوی و، دا وړاندیز کوي چې CT هم ډیری وخت ثابت شوی او د هایدروجیل جوړښت کې شامل شوی.د CT د یوې کوچنۍ برخې لپاره، کوم چې د مخکینۍ نمونې په څیر ګرځنده دی او په دې توګه د حل NMR لخوا لیدل کیږي، سپیکٹرا د لومړنیو 10 جوړښت شوي پاتې شونو لپاره سیګنالونه نلري، ممکن د His-NT2Rep د ضمیمې برخې ستونزمن حرکت له امله.د هایدروجیلونو -NT2RepCT د حالت NMR سپیکٹرا د α-helices او β-پرتونو غالب شتون څرګند کړ او تر یوې اندازې پورې د تصادفي کویل جوړښت (انځور 4b).یوازې په NT کې د میتیونین پاتې شونو کیمیاوي بدلون تحلیل ښودلې چې دا ډومین په β-شیټ جوړښت کې بدل شوی.په محلول کې د NT وخت پورې تړلې سپیکٹرا د سیګنال شدت کې یونیفورم کمښت ښودلی (انځور 4c) ، او د NT هایدروجیلونو جامد حالت NMR ښودلې چې د NT ډیری پاتې شونه په β-شیټ جوړښتونو بدل شوي (انځور 4d).د 2Rep جوړښت په جلا توګه نشي ټاکل کیدی ځکه چې د هغې د راټولولو تمایل.په هرصورت، د NTCT او His-NT2RepCT هایدروجیلونو جامد حالت NMR سپیکٹرا خورا ورته ښکاري (انځور 4b؛ ضمیمه انځور. 6b)، وړاندیز کوي چې 2Rep د His-NT2RepCT هایدروجیل ساختماني برخې کې لږ مرسته کړې.د CT هایدروجیلونو لپاره، α-helices، β-sheets، او تصادفي helical ثانوي جوړښتونه شتون درلود (اضافی شکل. 6d).دا وړاندیز کوي چې د CT ځینې برخې α-helices پاتې کیږي پداسې حال کې چې نور یې β-sheets کیږي.په دې توګه، د NMR سپیکٹروسکوپي پایلې وړاندیز کوي چې NT د هایدروجیل جوړښت لپاره مهم دی او همدارنګه د 2Rep او CT سره د فیوژن په وخت کې د β-شیټ په شکل بدلیږي.د دې سره په مطابقت کې، موږ په دې وروستیو کې وموندله چې د امیلایډ ځایي زپونه احتمال لري د NT ډومین په ټولو پنځو هیلیکونو کې جوړ شي، او والټز الګوریتم په هیلکس 1 (انځور 4e) کې د امیلایډوجینک سیمې وړاندوینه کړې.
د 15N-HSQC 2D سپیکٹرا 10 mg/mL His-NT2RepCT محلول مخکې (نیلي) او 19 ساعته وروسته د انکیوبیشن (سرخ) په 37 درجو کې.په سور طیف کې انفرادي کراس چوټي او په نیلي طیف کې F24, G136, polyA د واحد خط امینو اسید سمبولونو او پاتې شونو لخوا ښودل شوي.انسیټس د NT، 2Rep، او CT ډومینونو څخه د ټاکل شوي پاتې شونو لپاره په وخت کې د سیګنال شدت پورې تړاو ښیي.b د هز-NT2RepCT هایدروجیلونو د سالډ ریاست راډیو فریکونسی (RFDR) سپیکٹرا.د Cα/Cβ پاتې شونو ارتباط چې په RFDR سپیکٹرا کې مشاهده شوي د ماډل پیپټایډ کیمیاوي بدلونونو او ارزښتونو سره پرتله شوي چې د احصایې 82,83 او د دوی ثانوي جوړښتونو څخه اخیستل شوي.SSB - څرخیدونکی اړخ.c د 15N-HSQC 10 mg/mL NT محلول یو اړخیز سپیکٹرا د 36 ساعتونو لپاره په 37 ° C کې د انکیوبیشن پرمهال.انسیټ د وخت په پرتله حجمیتریک شدت ښیي.d د NT هایدروجیلونو جامد حالت RFDR سپیکٹرا.د Cα/Cβ د پاتې شونو ارتباط او د دوی ثانوي جوړښتونه چې په RFDR سپیکٹرا کې لیدل شوي ښودل شوي.د زپر ډیټابیس (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) څخه د NT45.79 فیبریلیشن پروپینسیت پروفایل پراساس.د هیکساپپټایډ د ځایي بریښنا د بدلون کړکۍ د Rosetta انرژي په kcal/mol کې ښودل شوي.سور بارونه د لوړ فایبرروسس سره د هیکساپیټایډونو نښه کوي (د Rosetta انرژي -23 kcal/mol لاندې؛ د ټکي کرښې لاندې).شنه بارونه د حد څخه پورته د Rosetta انرژی سره ټوټې ښیي او له همدې امله د سټیریک زپونو د جوړولو احتمال لږ دی.هغه ټوټې چې پرولین لري له تحلیل څخه ایستل شوي (پرته له کالمونو).چوکۍ د amyloidosis ساحې په ګوته کوي چې د والټز الګوریتم 81 (https://waltz.switchlab.org) لخوا وړاندوینه شوې.د NT د امینو اسید پاتې شونو ترتیب په سر کې دی، او د پاتې شونو ډولونه په β ثانوي جوړښت کې موندل شوي (د جامد حالت NMR سپیکٹروسکوپي لخوا ټاکل شوي) په سور کې ښودل شوي.د پنځو NT α-helices موقعیتونه د (H1-H5)28 په توګه ټاکل شوي.
په pH <6.5 کې، HT کمیږي، د تودوخې یا یوریا په واسطه د تخریب په وړاندې مقاومت لري.د دې روښانه کولو لپاره چې د NT dimerization او ثبات څنګه په جیلیشن اغیزه کوي، هغه محلولونه چې 100 mg/ml NT لري په pH 8، 7، او 6 کې د شیشې انعطاف ازموینې په کارولو سره کنټرول شوي.د NT نمونې په pH 8 او 7 کې د 30 دقیقو وروسته په 37 ° C کې جلا شوې، مګر د pH 8 جیل روښانه پاتې شو، پداسې حال کې چې د pH 7 جیل د لیدلو وړ باران ښودلی (انځور 5a).په مقابل کې، یو محلول چې په pH 6 کې HT لري جیل نه جوړوي، او یو لوی باران د 20 دقیقو وروسته په 37 درجې C کې لیدل کیدی شي.دا وړاندیز کوي چې dimers پخپله او / یا د دوی لوړ ثبات د مونومر په پرتله د جیلیشن مخه نیسي.په pH 7 او 6 کې د NT لپاره د اورښت رامینځته کیدو تمه نه وه ، ځکه چې راپور شوي چې NT په 200 mg/ml27 کې محلول کیږي ، په اسانۍ سره د تودوخې له تخریب وروسته بیرته راګرځي ، او همدارنګه په ټیټ ارزښت کې α-helix ساتي. pH 18. د دې توپیرونو لپاره یو احتمالي توضیح دا دی چې مخکې راپور شوي تجربې د خونې د حرارت درجه یا لاندې یا په نسبتا ټیټ پروټین غلظت 16,18,19 کې ترسره شوې.
د NT وایل انورسیشن ټیسټ (100 mg/mL) په pH 8, 7, 6 او 154 mM NaCl (pH 8) کې د انکیوبیشن وروسته په 37 ° C.b NT CD سپیکٹرا په ترتیب سره د 154 mM NaF او 154 mM NaCl سره او پرته.په 222 nm کې د مولر اوږدوالی د طبیعي پوښونو په تناسب بدلیږي.c NT د انحراف امتحان (100 mg/mL) NT* (37 °C او 60 °C)، NTA72R (37 °C)، او His-NT-L6 (37 °C او 60 °C).d د NT mutants NT*، NTA72R، او His-NT-L6 CD سپیکٹرا.په 222 nm کې د مولر اوږدوالی د طبیعي پوښونو په تناسب بدلیږي.د NTFlSp، NTMiSp او کم شوي NTMiSp (100 mg/mL) انعطاف ازموینه.د پیمانه بار 5 mm.د NT، NTFlSp، NTMiSp او کم شوي NTMiSp CD سپیکٹرا.په 222 nm کې د مولر اوږدوالی د طبیعي پوښونو په تناسب بدلیږي.بشپړ NT سپیکٹرا په 25 °C او 95 °C کې په ضمیمه 8 شکل کې ښودل شوي.
د فزیولوژیکي مالګې غلظت د NT فرعي واحدونو او ټیټ pH18 ته د NT لیږد dimerization تر مینځ الیکټروسټیک تعامل ټاکي.موږ وموندله چې د 154 mM NaCl او NaF شتون په حقیقت کې په ترتیب سره د جیلیشن مخه نیسي (انځور 5a، b؛ ضمیمه انځور. 2b) او دا چې دا مالګې د NT مونومرونو حرارتي ثبات زیاتوي (انځور 5b، تکمیلي شکل 8) .دا دا هم وړاندیز کوي چې د ډیمیر کولو پرځای د ثبات وده د جیل جوړیدو مخه نیسي.
په جیلیشن کې د پروټین ډیمیریزیشن او ثبات رول نور هم سپړلو لپاره، موږ دوه متغیرات، NT* او NTA72R کارولي، کوم چې په ټیټ pH28.30 کې مونومیریک پاتې کیږي.NT* د ډبل چارج ریورسل میوټینټ دی په کوم کې چې د مونومر څرګند ډیپولر چارج توزیع فلیټ شوی ، کوم چې د ډیمیریزیشن مخه نیسي او د مونومر ثبات په کلکه زیاتوي.NTA72R یو چارج شوی ډیپول دی، مګر د ارګ بدلیدونکی اله د ډیمر په سرحد کې موقعیت لري، نو بدلونونه د ډیمر کولو لپاره اړین سبونیټ تعاملاتو کې مداخله کوي.په 37 درجو کې د انکیوبیشن په وخت کې، NT* هایدروجیل نه جوړوي، په داسې حال کې چې NTA72R د 15 دقیقو لپاره یو ناپاک جیل جوړ کړ (انځور 5c).څرنګه چې NT* او NTA72R دواړه نشي کولی کم شي مګر د مونومر ثبات (انځور 5d) کې توپیر لري، دا پایلې په کلکه وړاندیز کوي چې لوړ ترموډینامیک ثبات د NT د جیلینګ مخه نیسي.دا د دې حقیقت لخوا هم ملاتړ کیږي چې HT* جیل جوړوي کله چې دا په لوړه تودوخه کې بې ثباته وي (د 8 دقیقو وروسته په 60 درجې کې؛ شکل 5c).دا دمخه ښودل شوي چې په NT کې د میتیونین لوړه محتوا د هغې طبیعي فولډ مایع کوي او دا شپږ میټ د لیو بدیلونه (دلته د His-NT-L6 په نوم یاد شوي) د NT46 مونومر په کلکه ثبات کوي.د دې انګیرنې پر بنسټ چې د NT جیل جوړونې لپاره ساختماني انعطاف ته اړتیا ده، موږ وموندله چې د His-NT-L6 مستحکم میوټینټ په 37 ° C (شکل 5c، d) کې جیل نه و.په هرصورت، His-NT-L6 د 60 دقیقو لپاره په 60°C کې د انکیوبیشن پرمهال جیل جوړ کړ (5c شکل).
د NT وړتیا د بیټا شیټ جوړښتونو ته د بدلون او هایدروجیلونو جوړولو لپاره داسې ښکاري چې په ځینو باندې پلي کیږي مګر د سپیډروین ټولو NT ډومینونو باندې نه.NTs د ورېښمو د مختلفو ډولونو او سپیډر ډولونو څخه، Trichonephila clavipes (NTFlSp)، د نسبتا ټیټ میتیونین مینځپانګې او لوړ حرارتي ثبات سره سره جیلونه جوړ کړي (انځور 5e، f او ضمیمه جدول 2).په مقابل کې، د ټيټ حرارتي ثبات او لوړ میتیونین محتوياتو سره د Araneus ventricosus (NTMiSp) څخه د کوچني امپولر پروټین سپیډروین څخه NT د هایدروجیل نه جوړیږي (اضافی جدول 2 او انځور 5e، f).وروستنۍ کیدای شي د انټرامولوکولر ډیسلفایډ بانډ 29,47 شتون سره تړاو ولري.په دوامداره توګه، کله چې د NTMiSp ډیسلفایډ بانډونه کم شول، دا د 10 دقیقو لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې د انکیوبیشن وروسته یو هایدروجیل جوړ کړ (انځور 5e).په پایله کې، دا باید په پام کې ونیول شي چې ساختماني انعطاف یو مهم دی، مګر د NT څخه د جیل د جوړولو لپاره یوازینی معیار نه دی.یو بل فاکتور چې ممکن اړوند وي د امیلایډ فایبریلونو رامینځته کولو تمایل دی ، او د زپ ډیټابیس او والټز الګوریتم سره تحلیل د جیلونو رامینځته کولو وړتیا او د امیلایډوجینک ساحو شتون ، او همدارنګه د وړاندوینې شوې ساحې حد ترمنځ اړیکه ښودلې. د سټیریک زپونو جوړولو لپاره.یو ارتباط شتون درلود (اضافی جدول 2 او تکمیلی شکل. 9).
د مناسبو شرایطو لاندې د فایبریلونو جوړولو او جیلونو جوړولو لپاره د NT وړتیا موږ دې ته اړ ایستلي چې د نورو پروټین ټوټې سره NT فیوژن لاهم د فیوژن شریکانو بشپړ فعالیت سره جیلونه رامینځته کولی شي.د دې ازموینې لپاره، موږ په ترتیب سره د NT په C-ټرمینس کې شنه فلوروسینټ پروټین (GFP) او purine nucleoside phosphorylase (PNP) معرفي کړل.نتیجه اخیستونکي فیوژن پروټینونه په E. کولی کې د خورا لوړ وروستي حاصلاتو سره څرګند شوي (په ترتیب سره د His-NT-GFP او His-NT-PNP لپاره 150 mg/L او 256 mg/L شیک فلاسک کلتورونه) د هغه څه سره مطابقت لري چې ښودل شوي. د نورو پروټینونو لپاره چې د NT Ref سره یوځای شوي.30. His-NT-GFP (300mg/mL) او His-NT-PNP (100mg/mL) فیوژن پروټینونه د 2 ساعتونو او 6.5 ساعتونو وروسته په 37 درجې سانتي ګراد کې جیلونه رامینځته کوي او مهم دا چې د GFP برخه بدله پاتې شوه.د جیلیشن وروسته مشاهده شوی، د 70٪ د ابتدايي فلوروسینس شدت سره د جیلیشن وروسته پاتې دی (انځور 6a).د هغه په ​​​​NT-PNP محلولونو او جیلونو کې د PNP فعالیت اندازه کولو لپاره ، موږ باید د فیوژن پروټین د NT سره ضعیف کړو ځکه چې د خالص چمتووالي انزیماتیک فعالیت د جیلینګ غلظت کې د تشخیص حد څخه بهر و.جیل د یو مخلوط سره جوړ شوی چې 0.01 mg/mL His-NT-PNP او 100 mg/mL NT لري د مخکینۍ انزیمیټ نمونو 65٪ لومړني انزیماتیک فعالیت ساتي (انځور 6b).جیل د اندازه کولو په جریان کې پاتې شو (اضافی شکل. 10).
د His-NT-GFP (300 mg/mL) د جیلیشن دمخه او وروسته د نسبي فلوروسینس شدت او د لید او UV رڼا لاندې د His-NT-GFP هایدروجیل (300 mg/mL) لرونکی شیشي.ټکي انفرادي اندازه ښیي (n = 3)، د تېروتنې بار معیاري انحراف ښیي.اوسط ارزښت د خطا بارونو په مرکز کې ښودل شوی.د PNP فعالیت د فلورومیټریک تحلیل په واسطه د محلولونو او جیلونو په کارولو سره ترلاسه شوی چې پکې NT (100 mg/ml) او یو مخلوط چې 0.01 mg/ml his-NT-PNP او 100 mg/ml نوي تایوان ډالر لري.انسیټ یو بدل شوی وایل ښیي چې یو هایدروجیل لري چې His-NT-PNP (5 mm پیمانه بار) لري.
دلته، موږ د NT او نورو recombinant spidroin پروټینونو څخه د 37 درجې C (شکل 1) کې د پروټین محلول په مینځلو سره د هایدروجیلونو رامینځته کیدو راپور ورکوو.موږ وښیو چې جیلیشن د α-helices په β-layers کې د بدلون او د امیلایډ په څیر فایبریلونو (انځر 3 او 4) رامینځته کیدو سره تړاو لري.دا موندنه د حیرانتیا وړ ده ځکه چې NTs د څو ورځو لپاره په 4°C کې د 200 mg/mL په غلظت کې د خورا لوړ محلول او لوړ ثبات لپاره پیژندل شوي ګلوبولر پنځه هیلکس بنډلونه دي.سربیره پردې، NTs په µM کې د ټیټ پروټین غلظت کې د تودوخې له تخریب وروسته په اسانۍ سره بیرته راګرځي.زموږ د پایلو له مخې، د فایبریل جوړښت د 10 mg/mL پروتین غلظت او یو څه لوړ شوي تودوخې ترکیب ته اړتیا لري (1 انځور).دا د دې مفکورې سره مطابقت لري چې امیلایډ فایبریل کولی شي د نړۍ په کچه پوښل شوي پروټینونو څخه جوړ شي چې د فیزولوژیکي شرایطو لاندې د حرارتي بدلونونو له امله په جزوي ډول ناڅرګند حالت کې دي 48.د پروټینونو مثالونه چې د دې تبادلې څخه تیریږي د انسولین 49,50، β2-مایکروګلوبولین، ټرانسټایرټین او لیزوزیم 51,52,53 شامل دي.که څه هم NT په خپل اصلي حالت کې یو α-helix دی، د پولیپپټایډ سلسله نږدې 65٪ د سټیریک زپ جوړښت (انځور 4e) 45 سره مطابقت لري.څرنګه چې مونومر په متحرک ډول ګرځنده 46 دی، دا کولی شي دا احتمالي امیلایډوجینک سیمې په اعتدال لوړ تودوخې کې افشا کړي او د ټول پروټین په لوړ غلظت کې د امیلایډ فایبریل جوړښت لپاره مهم غلظت ته ورسیږي54.د دې استدلال په تعقیب، موږ د سپیډروین غلظت او د جیلیشن وخت (انځور 1c) تر منځ منفي اړیکه وموندله، او که د مونومیریک NT جوړښت د بدلونونو (NT*, His-NT-L6) یا د مالګې اضافه کولو په واسطه ثبات ومومي، کولی شي د دې مخه ونیسي. د هایدروجیل جوړښت (5 شکل).
په ډیری حاالتو کې، امیلایډ فایبریلونه له محلول څخه د باران په توګه ورکیږي، مګر په ځینو شرایطو کې دوی کولی شي هایدروجیلونه 55,56,57 جوړ کړي.د هایدروجیل جوړونکي فایبریلونه په عمومي ډول د لوړ اړخ تناسب لري او د مالیکولي ښکیلتیا له لارې مستحکم درې اړخیزې شبکې جوړوي، 55,58 زموږ د پایلو سره مطابقت لري.په ویټرو کې د هایدروجیل جوړیدو لپاره، پروټینونه اکثرا په بشپړ یا جزوي توګه ښکاره کیږي، د بیلګې په توګه، د عضوي محلولونو سره د تودوخې، لوړه تودوخه (70-90°C) او/یا ټیټ pH (1.5-3.0) 59,60,61,62.د سپیډروین هایدروجیلونه چې دلته تشریح شوي سخت پروسس ته اړتیا نلري، او نه هم د هایدروجیلونو ثبات لپاره د کراس لینک کولو اجنټانو ته اړتیا لري.
مخکې راپور ورکړل شوی و چې د سپیډروین تکرار او QDs، چې د ورېښمو د سپینولو په وخت کې د β-شیټ سویچ کولو څخه تیریږي، هایدروجیل جوړوي.زموږ د موندنو په پرتله، د انکیوبیشن وختونه او/یا د انکیوبیشن تودوخه په ترتیب سره د پام وړ اوږده یا لوړه وه، او پایله شوي هایدروجیل اکثرا ناپاک وو (شکل 7 او ضمیمه جدول 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. د چټک جیل وختونو سربیره، NT هایدروجیل> 300 mg/mL (30%) د نورو ټولو تشریح شوي recombinant spider silk پروټین هایدروجیلونه، او همدارنګه طبیعي هایدروجیلونه لکه جیلاتین، alginate (2%)، agar (0.5%) ) او کولیجن.(0.6٪) (شکل 7 او ضمیمه جدول 1 او 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
پدې څیړنه کې د هایدروجیلونو جیل وخت او لچک لرونکي ماډل د نورو سپیډروین میشته هایدروجیلونو او غوره شوي طبیعي هایدروجیلونو سره پرتله شوي.حوالې د جیلیشن شرایطو توضیحاتو سره ورکړل شوي.APS امونیم پرسلفیټ، د خونې د حرارت درجه.ډاټا 37، 38، 39، 64، 65، 66، 67، 68، 69، 70، 71، 72، 73، 74.
داسې ښکاري چې سپیډروین د ذخیره کولو پرمهال د جیلینګ څخه مخنیوي لپاره لارې رامینځته کړي.د ورېښمو په غده کې د پروټین د لوړ غلظت سره سره، د ټرمینل ډومین سره تړلې لوی تکرار سیمه پدې معنی ده چې په غدې کې د NT او CT څرګند غلظت د دې مطالعې په حد کې نږدې 10-20 mg/ml سره مطابقت لري.د ویټرو مشاهده شوي هایدروجیل جوړښت لپاره اړین دی.برسېره پردې، د مالګې ورته غلظت 16 NT ثبات لري، لکه څنګه چې د ورېښمو غدود کې (انځور 5b).د NT تشکیلات په E. coli cytosol کې مطالعه شوي او موندل شوي چې په ویټرو کې د معاینې په پرتله ډیر کلک پوښل شوي، دا نور په ګوته کوي چې مالګه یا نور عوامل په ویوو کې د هغې د راټولیدو مخه نیسي.په هرصورت، د NTs وړتیا د β-شیټ فایبریلونو بدلولو لپاره ممکن د فلیمینټ جوړښت لپاره مهم وي او باید په راتلونکو مطالعاتو کې وڅیړل شي.
په دې څیړنه کې د NT-amyloid-like fibril او hydrogel جوړښت د نوو اړخونو سربیره، موږ دا هم په ډاګه کوو چې دا پدیده کیدای شي بایو ټیکنالوژیک او بایو میډیکل غوښتنلیکونه ولري (انځور 8).د مفهوم د ثبوت په توګه، موږ NT د GFP یا PNP سره یوځای کړ او وښودله چې د فیوژن پروټین هم هایدروجیلونه جوړوي کله چې په 37 سانتي ګراد کې کیښودل شي او دا چې د GFP او PNP برخې په پراخه کچه د جیلیشن وروسته خپل فعالیت ساتي (شکل 6).نیوکلیوسایډ فاسفوریلاسیس د نیوکلیوسایډ انالوګز 75 مهم کتلست ترکیب دی ، کوم چې زموږ کشف د بایوفرماسټیکل صنعت لپاره اړونده کوي.د فیوژن پروټینونو څرګندولو مفهوم چې په مناسبو شرایطو کې شفاف هایدروجیلونه جوړوي د پراخو غوښتنلیکونو لکه د انزایم اموبولوزیشن ، کنټرول شوي درملو خوشې کول او د نسج انجینرۍ لپاره د مناسب ملکیتونو سره فعال هایدروجیل رامینځته کولو ته اجازه ورکوي.برسېره پر دې، NT او NT* د اغېزمن څرګندونکي نښه 30 دي، دا پدې مانا ده چې NT او د هغې ډولونه د حل وړ فیوژن پروټینونو لوړ تولید تولید او په 3D هایدروجیلونو کې د غیر متحرک هدف پروټینونو رامینځته کولو لپاره کارول کیدی شي.
NT محلول کېدونکی، α-helical او په ټیټ غلظت (µM) او 37°C کې مستحکم دی.په ورته حرارت کې، مګر د غلظت په زیاتوالي کې (> 10 mg/ml)، NT جیلونه جوړوي چې د امیلایډ په څیر فایبریلونه لري.د NT فیوژن پروټینونه هم د بشپړ فعال فیوژن ټوټې سره فایبریلر جیلونه جوړوي، مختلف پروټینونه اجازه ورکوي چې د NT په کارولو سره په 3D هایدروجیلونو کې متحرک شي.لاندینۍ: NT (PDB: 4FBS) او د فایبر شبکو او اړونده پروټین جوړښتونو توضیحات (فرض شوي او په پیمانه ندي راښکته شوي، GFP PDB: 2B3Q، 10.2210/pdb2B3Q/pdb؛ PNP PDB: 4RJ2, 10.22bR/10.2240).
ساختمانونه (د بشپړ لیست لپاره ضمیمه جدول 4 وګورئ په شمول د امینو اسید سلسلې) په پلازمیډ pT7 کې کلون شوي او په E. coli BL21 (DE3) بدل شوي.E. coli چې انجنیري پلاسمیدونه لري په لوریا بروتھ کې د کنامیسین (70 mg/l) سره ضمیمه شوي او د شپې په 30 درجو او 250 rpm کې وده کوي.بیا کلتور 1/100 په LB متوسطه کې داخل شو چې کانامیسین پکې شامل وو او په 30 درجې C او 110 rpm کې تر OD600 پورې 0.8 ته رسیدل.د NMR مطالعاتو لپاره، باکتریا په M9 لږترلږه متوسطه کې کرل شوي چې 2 g D-glucose 13C (Aldrich) او 1 g امونیم کلورایډ 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) د پروتین لیبل کولو لپاره د آاسوټوپونو سره.د تودوخې درجه تر 20 درجو پورې راټیټه کړئ او د 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (وروستی غلظت) سره د پروټین څرګندونه رامینځته کړئ.د شپې د پروټین څرګندولو وروسته، حجرې د 20 دقیقو لپاره په 7278xg، 4°C کې راټول شوي.د حجرو ګولۍ په 20 mM Tris-HCl، pH 8 کې بیا ځنډول شوي، او تر بل کارونې پورې منجمد شوي.تړم شوي حجرې د 30 kPa کې د حجرو ګډوډونکي (TS لړۍ ماشینونه، کانسټنټ سیسټم محدود، انګلستان) په کارولو سره لیز شوي.بیا لیسات په 25,000 ګرامه کې د 30 دقیقو لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې سینټرفیوج شوي.د NTMiSp لپاره، ګولۍ بیا په 2 M یوریا، 20 mM Tris-HCl، pH 8 کې بیا ځای پرځای شوې وه، او د 2 دقیقو لپاره (2 s آن/بند، 65٪)، بیا بیا په 25,000 xg، 4 ° C. دننه کې سینټرفیوګ شوې. 30 دقیقېسوپرناټینټ د Ni-NTA کالم کې بار شوی و، د 20 mm Tris-HCl، 2 mm imidazole، pH 8 سره مینځل شوی، او په پای کې پروتین د 20 mm Tris-HCl، 200 mM imidazole، pH 8 سره مینځل شوی. د NT2RepCT او تولید لپاره. NTCT، thrombin هضم د هغه او NT ترمنځ سایټ (ThrCleav) معرفي کوي.د Thrombin cleavage سایټونه په His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep تولیدوي)، His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT تولیدوي)، His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT تولیدوي)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NT کې هم شتون لري. .* (NT* تولیدوي)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R تولیدوي)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp تولیدوي)، او His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTM تولیدوي).ساختمانونه د ترومبین (1:1000) سره هضم شوي او د شپې په 4° C کې د 20 mm Tris-HCl، pH 8 سره د سپیکٹرا/پور ډایلیسس جھلی په کارولو سره د 6-8 kDa مالیکولر وزن حد سره ډیالیز شوي.د ډایلیسز وروسته، محلول د Ni-NTA کالم کې بار کیږي او د ګټو پروتین لري راټولیږي.د پروټین غلظت په 280 nm کې د UV جذب اندازه کولو سره د هر پروټین د ختمیدو کوفیینټ په کارولو سره ټاکل شوی و، پرته له NTF1Sp، چې د تولید کونکي پروتوکول سره سم د بریډفورډ ارزونه کارولې.پاکوالی د SDS پولی کریلامایډ (4-20٪) جیل الیکٹروفورسیس او Coomassie روښانه نیلي داغ لخوا ټاکل شوی.پروټینونه د سینټرفیوج فلټرونو (VivaSpin 20, GE Healthcare) په کارولو سره په 4000 xg کې د 10 kDa مالیکولر وزن کمولو سره په 20 دقیقو کې متمرکز شوي.
د پروټین محلول وخورئ او په احتیاط سره 150 μl په 1 ملی لیتر روښانه سیپټم شیشې (8 x 40 mm Thermo Scientific) کې پیپ کړئ.ټیوبونه د پارافیلم سره تړل شوي او د تبخیر مخنیوي لپاره مهر شوي.نمونې (n = 3) په 37°C یا 60°C کې کینول شوي او په دوره توګه د جیلیشن مشاهده کولو لپاره بدل شوي.هغه نمونې چې جیل نلري لږترلږه د یوې اونۍ لپاره انکیوب شوي.د NTMiSp ډیسلفایډ بانډونه د 10 mM DTT سره په هر 10 µM پروټین کې کم کړئ.د طبیعی سپیډر ورېښمو پوښونو د جیلیشن تحلیل کولو لپاره، د سویډن برج سپیډر پرې شوی، دوه اصلي امپول شوي غدې په 200 μl کې د 20 mM Tris-HCl بفر pH 8 کې ځای په ځای شوي او پرې شوي ترڅو کوټ له غدود څخه جلا شي..د غدود منځپانګه په بفر کې منحل کیږي، د وچ وزن د ټاکلو لپاره 50 μl (په 60 °C کې د پرانستې ویالونو د انکیوبیشن په واسطه په ثابت وزن کې) او 150 μl د جیلیشن لپاره په 37 °C کې.
د اندازه کولو جیومیټری/وسله د سټینلیس فولادو څخه جوړه شوې ده چې د موازي پلیټ په کارولو سره د 20 ملي میتر پورتنۍ قطر او 0.5 ملي میتره خلا سره.نمونه له 25 ° C څخه تر 45 ° C پورې او بیرته 25 ° C ته د 1 ° C په یوه دقیقه کې د سټینلیس سټیل لاندې پیلټیر پلیټ په کارولو سره تودوخه کړئ.وایبریشن اندازه کول د 0.1 Hz په فریکونسۍ کې او د موادو په خطي ویسکویلاسټیک سیمه کې په ترتیب سره د 100 mg/mL او 300-500 mg/mL نمونو لپاره د 5% او 0.5% فشار سره ترسره شوي.د تبخیر مخنیوي لپاره د دودیز رطوبت خونه وکاروئ.ډاټا د Prism 9 په کارولو سره تحلیل شوي.
د 800 څخه تر 3900 سانتي مترو پورې د خونې په حرارت کې د انفراریډ (IR) سپیکٹرا راټولولو لپاره.د ATR وسیله، او همدارنګه د سپیکرومیټر له لارې د رڼا لاره، د تجربې دمخه او په جریان کې د وچ فلټر شوي هوا سره پاکه شوې.محلولونه (500 mg/mL په سپیکٹرا کې د اوبو د جذب چوکۍ کمولو لپاره) په کرسټالونو کې پایپ شوي، او جیلونه (500 mg/mL) د اندازه کولو دمخه جوړ شوي او بیا کرسټال ته لیږدول شوي (n = 3).1000 سکینونه د 2 cm-1 ریزولوشن سره او د 2 د صفر ډیوټ دورې سره ثبت شوي. دوهم مشتق د OPUS (Bruker) په کارولو سره د نهو ټکو د نرم حد په کارولو سره محاسبه شوی.سپیکٹرا د 1720 او 1580 cm-1 ترمنځ د ورته ادغام سیمې ته د F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" په کارولو سره نورمال شوي.په ATR-IR سپیکٹروسکوپي کې، په نمونه کې د انفراریډ بیم د ننوتلو ژوره د ویونمبر پورې تړلې ده، چې په پایله کې د لوړ موج نمبرونو په پرتله په ټیټ موجونو کې قوي جذب کیږي.دا اغیزې په انځر کې ښودل شوي سپیکٹرا لپاره سم ندي شوي.3 ځکه چې دوی خورا کوچني دي (اضافی شکل. 4).د دې ارقامو لپاره سم سپیکٹرا د بروکر OPUS سافټویر په کارولو سره محاسبه شوي.
په اصولو کې، د امایډ I په چوکۍ کې د اجزاو د باور وړ تخریب وروسته د پروټین ترکیبونو جامع اندازه کول ممکن دي.په هرصورت، په عمل کې ځینې خنډونه رامنځته کیږي.په سپیکٹرم کې شور کولی شي د (دروغ) چوټیو په څیر څرګند شي د ډیکنولیشن پرمهال.برسېره پردې، د اوبو د خړوبولو له امله لوړوالی د امایډ I چوټۍ موقعیت سره سمون لري او ممکن د نمونو لپاره ورته اندازه ولري چې د اوبو لوی مقدار لري، لکه د اوبو جیل چې دلته مطالعه شوي.له همدې امله، موږ هڅه نه ده کړې چې د امایډ I څوکۍ په بشپړه توګه تخریب کړو، او زموږ مشاهدې باید یوازې د نورو میتودونو لکه NMR سپیکٹروسکوپي په ملاتړ په پام کې ونیول شي.
د 50 mg/ml NT او His-NT2RepCT محلولونه د شپې په 37 درجې سانتي ګراد کې جیل شوي.هایدروجیل بیا د 20 mM Tris-HCl (pH 8) سره د 12.5 mg/ml په غلظت کې مینځل شوی ، ښه وڅښل شو او د جیل ماتولو لپاره پایپټ شو.بیا وروسته، هایدروجیل 10 ځله د 20 mm Tris-HCl (pH 8) سره 10 ځله مینځل شوی، د نمونې 5 μl د مسو په پوښ ​​کې تطبیق شوی و چې د فارموار سره پوښل شوی و، او اضافي نمونه د بلاټینګ کاغذ سره لیرې شوه.نمونې دوه ځله د 5 µl ملی کیو اوبو سره مینځل شوي او د 1٪ یورانیل فارمیټ سره د 5 دقیقو لپاره داغ شوي.اضافي داغ د جذب کاغذ سره لرې کړئ، بیا میش په هوا کې وچ کړئ.امیجنگ په دې گرډونو کې د FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN په کارولو سره ترسره شوي چې په 100 kV کې فعالیت کوي.انځورونه د ویلټا 2k × 2k CCD کیمرې په کارولو سره په x 26,500 او x 43,000 کې ثبت شوي (اولمپس سافټ امیجنگ حلونه, GmbH, مونسټر, جرمني).د هرې نمونې لپاره (n = 1)، 10-15 انځورونه ثبت شوي.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) د انځور تحلیل او د فایبر قطر اندازه کولو لپاره کارول کیده (n = 100، مختلف فایبرونه).Prism 9 د نه جوړه ټي ټیسټونو ترسره کولو لپاره کارول کیده (دوه لکۍ).منځنی His-NT2RepCT او NT فایبریلونه په ترتیب سره 11.43 (SD 2.035) او 7.67 (SD 1.389) nm وو.د باور وقفه (95٪) -4.246 ته -3.275 ده.د آزادۍ درجې = 198، p <0.0001.
80 µl د مایع نمونې چې 10 µM thioflavin T (ThT) لري په درې اړخیزه (n = 3) کې په جامد شرایطو کې د Corning 96-well تور لاندې روښانه لاندې پلیټونو (Corning Glass 3881, USA) په کارولو سره اندازه شوې.د فلوروسینس توپیرونه د 440 nm excitation فلټر او 480 nm اخراج فلټر (FLUOSstar Galaxy from BMG Labtech, Offenburg, Germany) په کارولو سره ثبت شوي.د ThT سیګنال نه سیګنال شوی او نه هم قانع شوی، ځکه چې د ThT د مختلف غلظت سره تجربې پرته له دې چې د سیګنال شدت بدل کړي ترسره شوي.د دوړې اندازه کولو لپاره په 360 nm کې جذب ثبت کړئ.د تخم د تجربو لپاره، 100 mg/mL جیلونه په 37° C. کې جوړ شوي، بیا ځای پر ځای شوي، او د 5٪، 10٪، او 20٪ د مولر تناسب کې د تخم کولو لپاره کارول کیږي.ډاټا د Prism 9 په کارولو سره تحلیل شوي.
د His-NT2RepCT او NT> 100 mg/mL ذخیره په یخ کې وخورئ او د 0.22 µm فلټر له لارې فلټر کړئ.غلظت د Nanodrop په کارولو سره په 280 nm کې د جذب اندازه کولو سره محاسبه شوي.د 96 څاه تور غیر پابند پلیټ (کورنینګ) په څاه کې چې روښانه لاندې لري، نمونې په 20 ملی ګرامه / ملی لیتر کې په 20 mM Tris-HCl pH 8 کې حل شوي او د 5 μM ThT (وروستی غلظت) سره مخلوط شوي، د نمونې ټول غلظت 50 μl حجم.نمونې په هرو 10 دقیقو کې په 37 ° C کې د CellObserver (Zeiss) مایکروسکوپ کې د لیږد شوي ر lightا چینل او FITC حوصلې او د ThT امیج کولو لپاره د اخراج فلټر سیټونو سره عکس اخیستل شوي.د 20x/0.4 لینز د عکس اخیستلو لپاره کارول کیږي.زین بلیو (Zeiss) او ImageJ (https://imagej.nih.gov/) د عکس تحلیل لپاره کارول شوي.جیلونه هم د NT او His-NT2RepCT محلولونو څخه د 50 mg/mL په غلظت کې چمتو شوي چې 20 mM Tris pH 8 او 5 µM ThT لري او د 90 دقیقو لپاره په 37 ° C کې سینګار شوي.د جیل ټوټې یوې نوې څاه ته لیږدول شوي چې 20 mM Tris، pH 8، او 5 μM ThT لري په غیر پابند تور 96 ښه روښانه لاندې پلیټ کې.په 20x/0.4 میګنیفیکشن کې د شنه فلوروسینس او ​​روښانه ساحې عکسونه ترلاسه کړئ.ImageJ د عکس تحلیل لپاره کارول شوی و.
د حل NMR سپیکٹرا په 310 K کې په 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer کې ترلاسه شوي چې د QCI Quadrupole Resonance Pulse Gradient Field Cryoprobe (HFCN) سره سمبال شوي.د NMR نمونې چې 10 mg/mL همجنس پروټین لري د 13C، 15N سره لیبل شوي، په 20 mm Tris-HCl (pH 8) کې منحل شوي، 0.02٪ (w/v) NaN3، 5٪ DO (v/v)، (n = 1) .د NT2RepCT کیمیاوي بدلونونه په pH 6.7 کې د 15N-HSQC په 2D سپیکٹرم کې د 23 لوړ ټاکلو لپاره کارول شوي.
د 13C، 15N-لیبل شوي هایدروجیلونو جادو زاویه سپینګ جامد NMR (MAS) سپیکٹرا په 800 MHz کې د 3.2 mm 13C/15N{1H} برقی تحقیقاتو سره مجهز شوي په Bruker Avance III HD سپیکٹرومیټر کې ثبت شوي.د نمونې تودوخې د متغیر حرارت ګاز جریان په 277 KHz کې کنټرول شوې. دوه اړخیز ډیپول گردشي ریزونانس (DARR) 76 او د راډیو فریکونسۍ بیا نښلونې (RFDR) 77 سپیکٹرا په ترتیب سره د 12.5 kHz او 20 kHz MAS فریکونسیو کې ترلاسه شوي.کراس پولرائزیشن (CP) له 1H څخه تر 13C پورې د 60.0 څخه تر 48.0 kHz پورې په 1H کې د خطي ریمپ په کارولو سره ترسره شو، 61.3/71.6 kHz په 13C کې (په 12.5/20 kHz MAS کې) او د تماس وخت 0.5-1 ms.په 73.5 kHz کې د نخاع 6478 ډیکوپلینګ د معلوماتو راټولولو پرمهال کارول شوی و.د استملاک وخت 10 ملی ثانیه و او د دورې ځنډ 2.5 ثانیې و.د RFDR سپیکٹرا کې لیدل شوي واحد تړل شوي Cα/Cβ ارتباط د DARR سپیکٹرا کې د ځانګړتیاو د پاتې شونو ډول کیمیاوي بدلونونو او د ضرب تړل شوي ارتباط پر بنسټ ټاکل شوي.
د Zipper79 ډیټابیس (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) د NT، NTFlSp، او NTMiSp لپاره د وهلو تمایلاتو او Rosetta انرژي ارزولو لپاره کارول شوی و.د Zipper ډیټابیس د Rosetta Energy80 محاسبه کوي، کوم چې د پروټین جوړښت ماډل کولو او تحلیل کولو لپاره د وړیا انرژۍ ډیری فعالیتونه سره یوځای کوي.د انرژي کچه -23 kcal/mol یا ټیټه د فایبریلټ لوړ تمایل په ګوته کوي.ټیټه انرژي د زپ په جوړښت کې د دوه β-strands ډیر ثبات معنی لري.برسېره پردې، د والټز الګوریتم په NT، NTFlSp او NTMiSp Ref کې د امیلایډوجینک سیمو اټکل کولو لپاره کارول کیده.81. (https://waltz.switchlab.org/).
د NT پروټین محلول د 2-(N-morpholino) ایتانیسلفونیک اسید (MES) بفر سره په pH 5.5 او 6.0 کې مخلوط شوی ترڅو pH په ترتیب سره 6 او 7 ته راټیټ کړي.د پروټین وروستی غلظت 100 mg/ml و.
اندازه کول په J-1500 CD سپیکرومیټر (JASCO, USA) کې د 300 μL کیویټ په کارولو سره د 0.1 سانتي مترو په نظري لاره سره ترسره شوي.پروټینونه په 20 mm فاسفیټ بفر (pH 8) کې 10 μM (n = 1) ته کم شوي.د مالګې په شتون کې د پروټین ثبات تحلیل کولو لپاره، پروټینونه په ترتیب سره په 20 mM فاسفیت بفر (pH 8) کې په ورته غلظت (n = 1) کې تحلیل شوي چې په ترتیب سره 154 mM NaF یا NaCl لري.د تودوخې سکینونه په 222 nm کې د 25 ° C څخه تر 95 ° C پورې د 1 ° C/min د تودوخې درجه سره ثبت شوي.د اصلي فولډ شوي پروټینونو تناسب د فارمول (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) په کارولو سره محاسبه شوی.برسېره پردې، پنځه سپیکٹرا د هرې نمونې لپاره د 260 nm څخه تر 190 nm پورې په 25 ° C او د تودوخې وروسته 95 ° C ته ثبت شوي.پنځه سپیکٹرا په اوسط ډول، نرم شوي او د مولر بیضاوي ته بدل شوي.ډاټا د Prism 9 په کارولو سره تحلیل شوي.
د His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) د فلوروسینس شدت د جامد شرایطو لاندې د تور شفاف لاندې (کورنینګ ګلاس 3881, USA) سره په 96-څاه کورنینګ پلیټونو کې په درې اړخیزه (n = 3) کې اندازه شوی.نمونې د فلوروسینس پر بنسټ پلیټ ریډر سره د 395 nm د جوش څپې اوږدوالی سره اندازه کړئ او اخراج په 509 nm کې د جیلیشن دمخه او 2 ساعته وروسته په 37 ° C کې ثبت کړئ.ډاټا د Prism 9 سره تحلیل شوي.
د Purine nucleoside phosphorylase فعالیت assay کټ (fluorometric میتود، Sigma Aldrich) د جوړونکي لارښوونو سره سم کارول شوی و.په جیلونو او محلولونو کې د فعالیت اندازه کولو لپاره چې His-NT-PNP لري، د His-NT-PNP 10 ng د 100 mg/mL NT سره د 2 µL ټول حجم سره مخلوط کړئ ځکه چې جیل د سیټ د کشف وقفې څخه پورته سیګنال ورکړی.د هز-NT-PNP پرته د جیلونو او حلونو کنټرول شامل وو.اندازه کول دوه ځله ترسره شوي (n = 2).د فعالیت اندازه کولو وروسته، د عکس العمل مخلوط لیرې شوی او جیل عکس اخیستل شوی ترڅو ډاډ ترلاسه کړي چې جیل د اندازه کولو په جریان کې پاتې دی.ډاټا د Prism 9 په کارولو سره تحلیل شوي.
د مطالعې ډیزاین په اړه د نورو معلوماتو لپاره ، د دې مقالې سره تړلی د طبیعت مطالعې خلاصې وګورئ.
شکل 1 او 2 لومړني معلومات وړاندې کوي.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f، او 6، اضافي انځر.3، ضمیمه انځر.5a، d، ضمیمه انځر.6 او اضافي انځر.8. د دې مطالعې څخه د معلوماتو ډاټا د زینوډو ډیټابیس https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 کې کوربه شوی.پدې څیړنه کې ترلاسه شوي د NMR ډیټا د BMRBig ذخیره ته د ننوتلو ID bmrbig36 لاندې ځړول شوي.د GFP او PNP جوړښتونه د PDB (GFP 2B3Q، PNP 4RJ2) څخه اخیستل شوي.
ریزینګ، A. او جوهانسن، J. د مصنوعي سپیډر ورېښمو سپننګ.ملي کیمیاوي.بیولوژي11، 309-315 (2015).
Babb، PL et al.د Nephila clavipes جینوم د سپیډر ورېښمو جینونو تنوع او د دوی پیچلي بیان روښانه کوي.ملي جینټ.49، 895-903 (2017).